大肠杆菌DPS表达、体外自组装及抗氧化作用研究

刘文 贾义华 方丽 刘长爱 陈浩 路凯敏 胡巍

氧和铁是生物必需的营养元素，参与代谢时会产生O2-、H2O2、·OH等自由基（Reactive oxygen species，ROS），造成氧化压力［1］，对 DNA、蛋白质、膜脂等细胞组分造成氧化损伤［2，3］。Almiron和Azam等［4，5］在长期饥饿培养的大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）中发现一种消除ROS的抗氧化蛋白，命名为DPS（DNA-binding proteins from starved cells）。现已证实DPS蛋白广泛分布于细菌体内，是一种重要的抗胁迫蛋白［6］。细菌处于生长静止期或受胁迫时在体内表达DPS蛋白，并与DNA结合，形成紧密的DPS-DNA复合体，保护DNA免受氧化损伤［7］。同时，作为铁蛋白超家族一员，DPS以十二聚体结构结合并储存铁，调节铁的供应，防止铁盐沉淀造成的毒性损伤［8，9］。十二聚体结构作为DPS发挥功能的重要结构基础，其自组装过程研究未见报道。本研究以大肠杆菌基因组为模板，用基因工程原核表达DPS，应用纯化的DPS观察其在体外条件下的自组装情况，旨在为研究其自组装和抗氧化活性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种、载体、培养基和试剂 菌株为大肠杆菌0111菌株和DH5α菌株（本实验室保存）。原核表达载体是pBV220质粒。LB细菌培养基由Oxiod公司胰蛋白胨和酵母提取物配制而成。鼠源抗HIS单抗（Anti-His mA）为Earthox产品，羊抗鼠辣根过氧化物酶标二抗购自北京中杉金桥生物技术公司。亲和层析用1mL His Trap FF crude column柱为GE公司产品。其他试剂为国产分析纯。

1.1.2 工具酶和试剂盒 核酸限制内切酶EcoR I、BamH I，Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶等均为Fermentas公司产品。多功能DNA纯化回收试剂盒、高纯质粒小量制备试剂盒、细菌基因组提取试剂盒均购自北京博大泰克公司。透析袋（Ф27 mm）为Union Carbide Corporation产品。DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计、基因扩增和表达载体构建 模板为提取的0111菌株基因组DNA。特异性上下游引物为5'-CGGAATTCATGAGTACCGC-3'和5'-GCGGATCCTTAGTGATGATGATGATGATGTTCGATGTTAGACTCG-3'，是参考GenBank中大肠杆菌dps基因序列设计，其中上游引物引入EcoR I酶切位点序列和ATG，下游引物引入6×His序列（斜体部分）、TAA以及BamH I酶切位点序列。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

目的基因和提取的pBV220质粒分别用EcoR I、BamH I双酶切，T4连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，阳性克隆进行双酶切和测序鉴定。基因测序送北京华大基因公司完成测序。

1.2.2 蛋白表达和纯化 工程菌在LB培养基中37℃培养至对数期，42℃过夜诱导表达目的蛋白。沉淀细胞超声破碎后分别取上清和沉淀，用SDS-PAGE（4％浓缩胶，12％分离胶）和Westernblotting检测鉴定目的蛋白。

用His Trap FF crude column亲和层析柱纯化目的蛋白。超声破碎菌体并提取包涵体，用含6mol/L脲的20mmol/L磷酸盐缓冲液（PB）溶解包涵体后加入到层析柱中，再用含100-400mmol/L咪唑的特异性洗脱缓冲液洗脱，SDS-PAGE分析洗脱组分。

1.2.3 DPS自组装鉴定 将纯化的DPS蛋白分别用含4、2和0.5mmol/L脲的PB缓冲液，分级逐步透析去除蛋白溶液中的6mmol/L脲，进行非变性PAGE电泳分析，浓缩胶为4％，分离胶为10％。

1.2.4 DPS对DNA的抗氧化保护 将等体积DPS（1.8mg/mL）和等体积pBV220质粒（40 ng/mL）混合后，加入等量的Fenton试剂（终浓度为10mmol/L H2O2，100mmol/L FeSO4，50mmol/L Tris-HCl），37℃孵育24h，1.2％琼脂糖电泳，检测质粒DNA降解情况。同时分别用质粒、加热变性的DPS、BSA蛋白与Fenton试剂孵育作为对照体系。

2 结果

2.1 目的基因扩增与表达载体构建

图1 pBVDPSHis载体及鉴定

经PCR扩增获得了一条特异性DNA片段，长度与dps基因522bp相当，重组载体双酶切鉴定也得到了该片段（图1）。经DNA测序鉴定，重组载体插入了3'-末端带有6×His标签的dps基因序列（测序结果略）。

2.2 DPS蛋白表达及纯化鉴定

从SDS-PAGE结果（图2-A）可以看出，42℃诱导的宿主细胞中存在分子量接近20kD的表达蛋白条带，该蛋白与DPS单体蛋白的理论分子量19.5kD相当。用Anti-His mA单抗进行Western blotting检测，结果（图2-B）表明，工程菌成功表达了带有HIS标签的DPS蛋白。另外，表达蛋白主要存在沉淀中，说明该蛋白是以包涵体形式获得高效表达。

图2 表达产物的SDS-PAGE（A）和Western blotting分析（B）

蛋白纯化后的SDS-PAGE结果（图3）显示，在特异性洗脱组分中含有目的蛋白（图3泳道6-9），其中300和400mmol/L咪唑洗脱组分中得到较纯的DPS蛋白。

图3 DPS蛋白SDS-PAGE结果

2.3 DPS体外自组装

纯化的DPS蛋白进行PAGE分析结果（图4）显示，DPS蛋白在6mmol/L脲的PB中出现多条条带，说明变性蛋白虽能组装成大分子量（十二）聚体，但仍然有大量的低聚体存在，分子量大多都超过66.7kD。相比而言，脲降低到0.5mmol/L时蛋白低聚体比例大大降低，大分子量（十二）聚体蛋白更加稳定。如果在0.5mmol/L脲的蛋白中添加NaCl，可以明显促进大分子聚合体的形成，特别是50mmol/L NaCl浓度时，几乎所有蛋白都自组装成稳定的十二聚体蛋白，说明NaCl能促进自组装过程。

图4 纯化的DPS蛋白PAGE结果

2.4 DPS对DNA的抗氧化保护

结果（图5）显示，Fenton反应后，质粒DNA在不含DPS的反应体系中被完全降解，在含DPS的反应体系中保持不变，在含热变性DPS的体系中被部分降解，而在含BSA蛋白的对照组同样被降解。上述结果说明，Fenton反应产生的羟基自由基对DNA分子造成氧化破坏，而DPS对DNA分子有抗氧化保护作用，加热变性后的DPS仍有部分保护作用，而且DPS对DNA的抗氧化保护是其特异性的功能，BSA不具备同样功能。

3 讨论

作为细菌内的抗氧化保护蛋白，DPS蛋白在菌体内翻译、自组装成十二聚体结构发挥作用。两个相邻DPS蛋白单体，侧面反向交叉形成一个面，六个面围城一个近乎球形的六面体，该球形六面体外径9nm，内径4.5nm，其中空腔穴带有负电荷，是铁成核及矿化部位［10］。有文献报道，DPS聚合体是由6个二聚体组合而成，也有说是4个三聚体组合而成［11，12］。本实验中观察到有不同分子量大小的聚合体，部分支持了这种观点，但也说明还可能存在其它聚体形式。实验中获得的纯化蛋白经除脲复性和添加NaCl后，可以形成稳定的分子量均一的聚合，这与文献报道的DPS十二聚体的活性结构相吻合［13］。因此可以确定基因工程表达的DPS能够自组装成十二聚体结构。而DPS在Fenton反应中对质粒DNA的保护作用的实验结果，证明体外表达纯化的DPS能够发挥抗氧化保护蛋白功能。

图5 质粒保护琼脂糖凝胶电泳结果

DPS一方面通过将Fe2+转化成羟基氧化铁（FeOOH）形式防止羟自由基产生［14］，并储存铁元素，调节铁的利用和储存间平衡；另一方面，DPS能够在逆境环境下与DNA分子形成非序列依赖性的DPS-DNA复合体结晶，稳定DNA分子［15-17］。有些病原菌甚至利用DPS蛋白的活性抵抗药物作用［18］。因此DPS结构及其抗氧化作用都是抗病原菌药物设计的潜在靶点。另外，DPS颗粒状结构还是小分子抗原的展示平台，可用于纳米疫苗的研究。

4 结论

基因工程原核表达的带有His标签的DPS蛋白，纯化后能自组装成稳定的十二聚体结构并具有抗氧化保护质粒DNA作用。

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