内源性大麻素系统对慢性间歇低氧大鼠糖代谢的影响

朱帅俊 翁钦永 吴文伟 (福建医科大学附属协和医院重症医学科，福建 福州 35000)

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征为一种常见的慢性病，在老年人群中有较高的发病率〔1〕。研究显示，该病与体内多脏器功能受损相关，为高血压、冠心病、脑卒中、糖尿病等多种慢性病的独立危险因素〔2〕。阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征主要病理生理学改变为夜间反复性慢性间歇低氧(CIH)，可明显提升糖尿病发生率〔3〕，但引发机体糖代谢异常的相关机制仍未明确。内源性大麻素系统为内源性信号转递系统的一种，在调节糖代谢方面具有重要作用〔4〕。但内源性大麻素系统在阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者体内糖代谢异常中发挥的作用和相关机制仍未知。本研究探讨内源性大麻系统对CIH大鼠糖代谢的影响机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物 10周龄健康Wistar大鼠60只，均为雄性，体重230～260 g，购于福建医大实验动物中心，许可证号SCXK(闽)200420002。随机分为4 w正常对照组、CIH组、CIH联合利莫那班组;6 w正常对照组、CIH组、CIH联合利莫那班组，每组各10只。

1.2 仪器与试剂 山羊抗兔CB1受体多克隆抗体、兔抗大鼠CB1受体多克隆抗体购于艾美捷科技有限公司;SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒购于北京北瑞达医药科技有限公司;利莫那班购于武汉同兴生物科技有限公司;日本东芝TBA-40FR全自动生化分析仪;瑞士罗氏Cobase411型电化学发光仪。

1.3 暴露方法 将6组大鼠分别放入型号相同的自制低氧舱，CIH组、CIH联合利莫那班组均循环充入不同流速的纯氮气和压缩空气，每次循环2 min，将低氧舱中的氧气浓度在30 s内从21.0%，下降到最低的8.0%，再于40 s内恢复到21.0%之后保持常规通氧到下个循环为止。大鼠每日暴露时间10∶00～16∶00，共6 h。CIH联合利莫那班组在造模之前腹腔注射利莫那班，1 mg·kg-1·d-1;正常对照组充入氧气浓度为21.0%的压缩空气。

1.4 空腹血糖(FPG)、血清胰岛素、血清C肽测定 分别于实验第4、6周，相应大鼠在空腹状态下给予10%水合氯醛(0.2 ml/100 g)麻醉后，抽取股静脉血4 ml。取其中2 ml使用全自动生化分析仪检测空腹血糖(FPG)含量，另外2 ml使用化学发光法检测胰岛素和C肽水平。

1.5 肝脏CB1受体表达检测 采用免疫组化法测定大鼠肝脏CB1受体表达水平，将大鼠处死后立即分离肝脏，制作石蜡切片。选用兔抗大鼠CB1受体多克隆抗体为一抗，稀释100倍;山羊抗兔CB1受体多克隆抗体为二抗。取每张染色切片的5个视野进行观察和采集，使用Image-pro plus 6.0软件检测该受体染色呈阳性的吸光度平均值。

1.6 统计学分析 采用SPSS16.0软件，计量资料组间比较进行方差分析，两两比较进行t检验，相关性进行Spearman分析。

2 结果

2.1 各组FPG、胰岛素和C肽水平比较 4 w和6 w CIH组FPG、胰岛素和C肽水平均明显高于正常对照组(P＜0.05);6 w CIH组FPG、胰岛素和C肽水平均明显高于4 w CIH组(P＜0.05);6 w CIH联合利莫那班组FPG、胰岛素和C肽水平均明显高于4 w CIH联合利莫那班组(P＜0.05)。见表1。

表1 各组FPG、胰岛素和C肽水平比较(±s，n=10)

表1 各组FPG、胰岛素和C肽水平比较(±s，n=10)

与正常对照组比较:1)P＜0.05，与4 w CIH 组比较:2)P＜0.05;与4 w CIH 联合利莫那组比较:3)P＜0.05

分组FPG(mmol/L)血清胰岛素(U/L)血清C肽(μg/L)6.59±0.348.95±1.821.34±0.376 w 正常对照组 6.62±0.389.07±1.241.39±0.444 w CIH 组 9.03±0.511) 16.61±2.841) 3.42±0.281)6 w CIH 组 10.55±0.421)2)20.14±3.751)2)5.34±0.361)2)4 w CIH 联合利莫那班组 7.73±0.2711.80±2.462.15±0.306 w CIH 联合利莫那班组 9.22±0.303) 14.72±2.733) 3.77±0.243)4 w正常对照组

2.2 大鼠肝脏CB1受体表达情况 4、6 w正常对照组CB1受体吸光度值为(0.225±0.037)、(0.232±0.041)，4、6 w CIH 组CB1 受体吸光度值为(0.285±0.037)、(0.338±0.026)，4、6 w CIH联合利莫那班组 CB1受体吸光度值为(0.253±0.016)、(0.310±0.027)。CB1 受体在4、6 w CIH 组阳性表达水平明显高于正常对照组(P＜0.05)。4、6 w CIH联合利莫那班组CB1受体阳性表达水平明显低于CIH组(P＜0.05)。见图1。

2.3 大鼠肝组织CB1受体表达与FPG、胰岛素和C肽水平相关性 大鼠肝组织CB1受体表达与FPG、胰岛素和C肽水平之间呈明显正相关(r=0.967、0.869、0.938，P=0.016、0.020、0.009)。

图1 大鼠肝组织CB1受体表达情况(×400)

3 讨论

目前已有研究证实，阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者存在血糖上升、胰岛素抵抗、腹型肥胖等多种与代谢综合征有关的临床症状，病情进一步发展会引发糖代谢异常和2型糖尿病发生风险增加〔5〕，但具体发病机制仍未明确。

前期研究显示，阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者存在内源性大麻素系统紊乱，主要表现为CB1受体表达水平提升〔6〕。本次研究亦显示CIH能够提升大鼠肝脏组织CB1受体表达水平，并随着低氧时间的变长而强度逐渐增加。由于内源性大麻素系统主要通过CB1受体来对机体多种生理功能发挥调节作用，因此对CB1受体的表达能够有效反映出内源性大麻系统功能的改变。本次研究显示，CIH能够通过诱导大鼠肝脏CB1受体过度表达来引发糖代谢紊乱。其原因可能为:(1)通过CIH增强机体的交感神经系统，激活炎性和氧化应激通路，进而引发内源性大麻系统紊乱，使糖代谢出现紊乱。(2)通过下丘脑中枢神经系统及骨骼肌、肝脏等外周组织这两种不同机制来引起胰岛素抵抗及高胰岛素血症。

利莫那班为一种高特异性的CB1受体拮抗剂。研究显示，使用利莫那班能够有效缓解机体糖代谢异常和胰岛素抵抗〔7〕。预试验显示，当利莫那班给药剂量低于1 mg·kg-1·d-1时无法减弱CB1受体表达水平，因此本次实验中在造模前给予大鼠利莫那班发挥药效的最低剂量1 mg·kg-1·d-1进行干预。结果显示，干预后大鼠肝脏CB1受体表达水平明显降低，说明内源性大麻素系统紊乱能够使CIH引起的糖代谢紊乱加强。可能机制为:(1)治疗初期可通过拮抗中枢神经CB1受体来抑制食欲，进而降低摄入食物量;(2)治疗后期可通过拮抗骨骼肌、肝脏等外周CB1受体来调节机体能量代谢，降低内源性大麻素系统紊乱和糖尿病的发生率。

综上所述，CIH可增强大鼠肝脏CB1受体表达，使FPG、胰岛素和C肽水平升高;利莫那班干预治疗能够有效改善糖代谢相关指标的异常状态。但本次研究中未深入研究利莫那班药效与给药剂量之间的关系;此外，给予利莫那班后部分糖代谢指标降低，但未完全恢复正常水平，可能与阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征引发的糖代谢紊乱还存在有除内源性大麻素系统之外的其他通路有关。

1 韩书芝，李 冲，苏 力，等.阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者血清内脂素的水平〔J〕.中国老年学杂志，2013;33(10):2358-60.

2 刘志青，傅柳英，李乐之，等.阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者抑郁状况及相关因素分析〔J〕.中南大学学报(医学版)，2010;35(10):1106-11.

3 李志刚，钱凤文，崔如众，等.持续气道正压通气治疗老年阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征合并糖尿病的临床分析〔J〕.天津医药，2014;(9):912-4.

4 郭庆畲.内源性大麻素系统在2型糖尿病与肥胖中生化机制〔J〕.医学综述，2009;15(10):1458-61.

5 刘新兵，冯六六，黄红漫，等.无创正压通气治疗对冠心病合并阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者心律失常影响研究〔J〕.中国循环杂志，2014;29(1):21-5.

6 郭超花，王 强.内源性大麻素系统与阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征〔C〕.//首届睡眠呼吸障碍性疾病多学科研讨会论文集，2009:157-61.

7 赵维元.中枢类大麻受体拮抗剂利莫那班对2型糖尿病周围神经病变疗效的实验分析〔J〕.神经疾病与精神卫生，2011;11(2):140-3.