多酶法提取榛蘑多糖及光谱研究

邹东恢　郭宏文

摘要： 研究了多酶法提取榛蘑多糖的最佳条件并进行光谱研究，通过单因素和正交试验确定了酶法提取榛蘑多糖的最佳工艺，即：粒度80目，料水比1 ∶ 20，酶作用温度40 ℃，加酶（加酶总量为底物的1%）质量比（木瓜蛋白酶 ∶ 纤维素酶）3 ∶ 1，pH值6 5，酶作用时间2 0 h；在此条件下多糖的提取率可达16 85%。红外光谱分析表明榛蘑多糖为含有葡萄糖醛酸的β-吡喃多糖。

关键词： 榛蘑多糖；多酶法提取；正交试验；光谱分析

中图分类号： R284 2 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2015）08-0276-03

榛蘑多糖（AMP）是从榛蘑菌丝体、子实体和发酵产物中分离而来的，是一种能够控制细胞的分裂分化和调节细胞生长衰老的活性多糖，同时它还具有抗辐射、促进造血、抑制肿瘤生长、调节免疫等药理作用 [1-2]。此外，榛蘑多糖也具有一定的抗氧化能力，可以用于制备具有抗氧化活性的天然活性物质。榛蘑多糖提取可以采用热水、稀酸、稀碱作为浸提剂，也可采用微波法、超声波法辅助提取，浸提法是提取榛蘑多糖的传统方法，但时间长、效率低、能耗大 [3]，多糖的提取率普遍不高。酶法提取多糖简单快捷、省时低耗，对榛蘑多糖的工业化提取及生产具有非常重要的现实意义。

1 材料与方法

1 1 原料处理

将市场上购买的榛蘑根部去除后，用清水清洗干净，用剪刀将菌伞剪成适当的小块，放入真空干燥箱中干燥，用粉碎机粉碎，将粉碎后的榛蘑干粉依次通过20、40、60、80目的筛子，之后将各级的榛蘑粉放入洁净干燥的烧杯中，并将其置于干燥箱中待用。

1 2 试剂与仪器

SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵：河南省巩义市予华仪器有限责任公司；离心机：上海跃进医疗器械厂；RH-Q型全温振荡器：江苏省全坛市荣华仪器制造有限公司；722紫外分光光度计：北京赛多利斯仪器系统有限公司；Lambda-35紫外可见分光光度计：美国PE公司；木瓜蛋白酶：北京世纪时尚科贸有限公司；纤维素酶：国药集团化学试剂有限公司；所使用的试剂均为分析纯。

1 3 葡萄糖标准曲线的制作

以测定的吸光度D作为纵坐标，葡萄糖的质量浓度C作为横坐标，用苯酚-硫酸法测定多糖含量，绘制出葡萄糖标准曲线为y=12 313 0x-0 029 1，相关系数为r=0 999 1。

1 4 酶法提取榛蘑多糖的方法

精确称取80目的榛蘑粉2 g于锥形瓶中，按照一定的料水质量比加入蒸馏水，用pH计调节pH值，按照一定加酶比加入木瓜蛋白酶和纤维素酶（加酶总量为底物的1%），在恒温振荡器上振荡一定时间，用100 ℃沸水锅水浴10 min，灭酶，在冷却至室温之后，用 8 000 r/min 离心机离心10 min，取上清液，即得到酶提取多糖清液。

1 5 多糖总量的测定

采用苯酚-硫酸比色法 [4]。硫酸-苯酚法是以硫酸、苯酚作为显色剂，与榛蘑多糖发生显色反应，在490 nm波长处测定吸光度，再通过已经测定的葡萄糖标准曲线计算求得榛蘑中的多糖含量。

1 6 蛋白质去除方法

本试验采用Sevage法 [5]来去除榛蘑多糖溶液中的杂蛋白质。配制氯仿-正丁醇溶液，两者的体积比为4 ∶ 1，在榛蘑多糖溶液中加入其1/4体积的氯仿-正丁醇溶液，将其置于大锥形瓶中，充分摇匀30 min之后，静置，去除溶液下面的白色混浊物；取上清液于另一锥形瓶中，重复操作3～4次后，即可除去榛蘑多糖溶液中的蛋白质。

2 结果与分析

2 1 单因素试验条件确定

2 1 1 物料粒度对榛蘑多糖提取的影响 从图1可知，20、40、60、80目的榛蘑粉提取的多糖分别为10 26%、1048%、10 65%和12 08%，由此可知80目的榛蘑粉提取的多糖最高，因此试验选定物料粒度为80目。

2 1 2 料水质量比对榛蘑多糖提取的影响 从图2可知，料水质量比为1 ∶ 5、1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20的条件下榛蘑粉提取的多糖分别为7 02%、10 24%、11 97%和12 37%，因此试验确定料水质量比为1 ∶ 20。

2 1 3 pH值对榛蘑多糖提取的影响 从图3可知，pH值为4 5、5 5、6 5、7 5的条件下榛蘑粉提取的多糖为1081%、10 47%、12 93%和10 04%，由此可知pH值为6 5时的榛蘑粉提取的多糖最高（图3），因此试验选定pH值为6 5。

2 1 4 温度对榛蘑多糖提取的影响 从图4可知，温度为30、40、50、60 ℃的条件下榛蘑提取的多糖分别为11 63%、12 88%、13 69%和12 59%，当温度在30～50 ℃之间时，随着温度的升高，多糖提取率较快地增长，继续升高温度提取的多糖便有了下降的趋势，因此试验确定温度为50 ℃。

2 1 5 时间对榛蘑多糖提取的影响 从图5可知，时间为0 5、1 0、1 5、2 0 h的条件下测定榛蘑粉的多糖提取率，以2 0 h的条件下最高，因此试验选定时间为2 0 h。

2 1 6 加酶质量比对榛蘑多糖提取的影响 从图6可以看出，当加酶总量为底物的1%时，随着加酶质量比（木瓜蛋白酶：纤维素酶）的增大提取的多糖也逐渐增加，当酶比为3 ∶ 1时，提取率开始下降，考虑到酶的成本及效果，加酶质量比应为2 ∶ 1。

2 2 榛蘑多糖提取的正交试验结果分析

2 2 1 因素与水平 在单因素试验的基础上，选择影响榛蘑多糖提取的主要因素加酶（加酶总量为底物的1%）质量比（木瓜蛋白酶 ∶ 纤维素酶）、酶解温度、pH值、酶解时间进行四因素三水平正交试验（表1），确定提取榛蘑多糖的最佳条件。

2 2 2 正交试验结果 由表2中4个因素的极差值可知，影响榛蘑多糖提取率的4个因素的主次顺序是A>B>D>C。通过正交试验可知复合酶法提取榛蘑多糖的最佳工艺条件为A3B1C2D3，即加酶质量比（木瓜蛋白酶 ∶ 纤维素酶）为 3 ∶ 1，酶解温度为40 ℃，pH值6 5，酶解时间2 0 h，此时榛蘑多糖的提取率为16 85%。

2 3 榛蘑粗多糖的脱色与醇沉提取

将除净蛋白质的多糖溶液用20 g/L的活性炭脱色1 h，抽滤后再10 000 r/min离心10 min。将离心后的上清液放入锥形瓶中，加入大于溶液体积75%的乙醇，然后置于4 ℃冰箱中醇沉24 h。取出后用离心机8 000 r/min离心15 min，取出沉淀物放入表面皿中，在真空干燥箱中干燥，得到榛蘑粗多糖。

2 4 色谱分离纯化

取粗多糖10 mL上柱。用恒流泵控制流速（20 mL/h），自[CM（25]动部分收集器收集，每管收集2 0 mL，用苯酚-硫酸法测定各洗脱液于490 nm处的吸光度，收集其流出液，冷冻干燥得到纯化样品。

2 5 榛蘑多糖结构红外吸收光谱分析结果

红外光谱和分子结构有着极其密切的关系，已成为测定分子结构的一种重要方法。由于红外光谱仪的广泛应用，现在已成为一种常规的分析测试手段。由图7可知，由多糖中O—H、N—H伸缩振动引起3 418 17 cm -1处的峰值；在2 929 88 cm -1处吸收峰是由多糖中C—H的伸缩振动引起的，是糖类的特征吸收；在1 641 61 cm -1处吸收峰是—CHO的C[FY=，1]O的非对称伸缩振动引起的，为肽链上酰胺碳基的吸收峰；在1 402 05 cm -1处吸收峰是由多糖中C—O—C和C—O—H的伸缩振动引起的；在1 247 92 cm -1处的吸收峰是由多糖中C[FY=，1]O的对称性伸缩振动引起的，说明有羧酸的存在；在1 137 32 cm -1处吸收峰是由多糖中D-吡喃葡萄糖伸缩振动引起的；在1 073 57 cm -1处吸收峰是由多糖中β-D-吡喃葡萄糖苷伸缩振动引起的；在871 88 cm -1为β-吡喃环中C1—H的变角振动吸收峰；在805 52 cm -1处是由吡喃环中C1—H的变角振动引起的。由此可知，榛蘑多糖为含有葡萄糖醛酸的β-吡喃多糖。

2 6 榛蘑多糖结构紫外吸收光谱分析结果

紫外吸收光谱应用广泛，可用于有机化合物的结构表征和有机化合物的定量分析 [6]。由图8可知，得到的紫外吸收光谱显示核酸和蛋白质的含量较小，因为在核酸（吸收峰260 nm）和蛋白质（吸收峰280 nm）吸收波长处未出现峰值。

3 结果与讨论

本试验中，首先采用单因素试验确定优化条件，即：物料粒度为80目，料液质量比为1 ∶ 20，然后采用正交试验的方法来进一步优化榛蘑多糖的提取条件，得到提取榛蘑多糖的最佳优化条件，即为提取温度40 ℃，pH值6 5，酶解时间2 0 h， 加酶（加酶总量为底物的1%）质量比（木瓜蛋白酶 ∶ 纤维素酶） 3 ∶ 1，最佳优化条件的榛蘑多糖提取率达到16 85%。

采用Spectum one傅里叶变换红外光谱仪对干燥后的榛蘑多糖进行结构分析，由多糖中O—H、N—H伸缩振动引起 3 418 17 cm -1处的峰值；在2 929 88 cm -1处吸收峰是由多糖中C—H的伸缩振动引起的，是糖类的特征吸收；在1 641 61 cm -1处吸收峰是—CHO的C[FY=，1]O的非对称伸缩振动引起的，为肽链上酰胺碳基的吸收峰；在1 402 05 cm -1处吸收峰是由多糖中C—O—C和C—O—H的伸缩振动引起的；在1 247 92 cm -1处的吸收峰是由多糖中C[FY=，1]O的对称性伸缩振动引起的，说明有羧酸的存在；在1 137 32 cm -1处吸收峰是由多糖中D-吡喃葡萄糖伸缩振动引起的；在1 073 57 cm -1 处吸收峰是由多糖中β-D-吡喃葡萄糖苷伸缩振动引起的；在871 88 cm -1为β-吡喃环中C1—H的变角振动吸收峰；在805 52 cm -1处是由吡喃环中C1—H的变角振动引起的。由此可知，榛蘑多糖为含有葡萄糖醛酸的β-吡喃多糖。

采用Lambda-35型紫外可见光分光光度计对榛蘑多糖进行紫外光谱扫描，得到一条较为光滑的曲线，在260 nm和280 nm处都没有出现峰值，由此可知榛蘑多糖中核酸和蛋白质的含量较少。

参考文献：

[1] 秦俊哲，吕嘉枥 食用菌栽培学[M] 杨凌：西北农林科技大学出版社，2002：213

[2]Franz G Polysaccharides in pharmacy：current applications and future concepts[J] Planta Medica，1989，55（6）：493-497

[3]邵信儒，孙海涛，赵晓春 山榛蘑多糖提取工艺研究[J] 食品工业科技，2010，31（2）：224-225，228

[4]王小东，慧 玲，王顺启 真菌多糖的研究进展[J] 江西科学，2005，23（3）：43-46

[5]Sham P Y，Scaman C H，Durance T D Texture of vacuum microwave dehydrated apple chips as affected by calcium pretreatment，vacuum level and apple variety[J] Journal of Food Science，2001，66（9）：1341-1347

[6]叶姜瑜，谈 锋 紫芝多糖的纯化及组分分析[J] 西南师范大学学报：自然科学版，2002，27（6）：945-949