酿酒葡萄“蛇龙珠”茎尖复苏及生茎培养基的筛选

陈春伶　徐美隆　杨智等

摘要： 以B5改良的培养基作为基本培养基，比较了添加不同浓度6-BA与IBA组合的培养基对酿酒葡萄“蛇龙珠”茎尖复苏及生茎的影响，筛选出适合蛇 龙珠试管苗茎尖复苏的培养基为B5（改良）+1 5 mg/L 6-BA+0 05 mg/L [JP3]IBA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂，pH值5 8～6 0；筛选出适合蛇龙珠试管苗生茎的培养基为B5（改良）+1 5 mg/L 6-BA+ 01 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂，pH值=5 8～6 0。

关键词： 酿酒葡萄“蛇龙珠”；茎尖复苏培养基；生茎培养基

中图分类号：S663 104 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2015）08-0174-02

蛇龙珠，酿酒葡萄品种，别称解百纳；欧亚种，原产法国，为法国的古老品种之一，与赤霞珠、品丽珠是姊妹品种；1892年引入中国，现在山东烟台、宁夏等地区有较多栽培。葡萄茎尖因其顶端分生细胞分裂生长速度大于病毒在细胞间传递感染的速度，加之顶端分生组织代谢产生的内源激素对病毒具有钝化作用 [1]，所以茎尖顶端分生组织通常不含或含少量病毒 [1-5]。因此，通过蛇龙珠茎尖剥离脱毒技术，获取无病毒组织，再进行组织培养，可得到脱毒的蛇龙珠健康植株。本研究通过筛选脱毒过程中茎尖复苏培养基及生茎培养基，以期获得适合蛇龙珠的优良茎尖顺利复苏生长的培养基，为蛇龙珠的无毒苗快繁提供技术支持。

1 材料与方法

1 1 材料

复苏培养材料：4周龄蛇龙珠试管苗茎尖；生茎培养材料：在茎尖复苏培养基上培养3周的葡萄茎尖发育成的小苗。

1 2 方法

本研究以0 8～1 0 mm的蛇龙珠试管苗茎尖为脱毒处理材料，处理后的茎尖需要复苏培养才能生长为完整的植株。参考Wang等的研究 [6-8]，设计试验。茎尖复苏培养基及生茎培养基均以B5为基础培养基，对6-BA和IBA 2种植物生长调节剂进行浓度筛选。

1 2 1 复苏培养基筛选

根据文献报道以B5（改良）为基础培养基，对6-BA设计1 0、1 5、2 0 mg/L 等3个水平，对IBA设 计0 05、0 10、0 15、0 20 mg/L等4个水平，设计完全试验，配制培养基（附加30 g/L蔗糖和7 g/L琼脂，以形成固体培养基），倒茎尖复苏培养基平板；以4周龄蛇龙珠试管苗为材料，解剖镜下取 0 8～1 0 mm 茎尖于待筛选的茎尖复苏培养平板中，每板15个茎尖，每个处理设置3次重复；避光暗培养 3 d，然后光照培养。培养条件：温度（25±2）℃；光照度2 000～2 500 lx；光照时间16 h/d。1周后统计成活率，2周后统计生长状态。

1 2 2 生茎培养基筛选

根据文献资料以B5（改良）为基础培养基，设定6-BA为1 0、1 5、2 0 mg/L，设完IBA为 0 05、0 10、0 15、0 20、0 30 mg/L 5个水平，设计完全试验，配制生茎培养基（附加30 g/L蔗糖和7 g/L琼脂，以形成固体培养基），倒入300 mL玻璃瓶内，每瓶60 mL。以茎尖复苏培养基处理1、处理5所得到的3周龄茎尖为材料，每瓶生茎培养基接种3～4株葡萄小苗；光照培养，培养条件：温度 （25±2） ℃，光照度2 000～2 500 lx，光照时间 16 h/d。4周后统计成活率及生长状况。

2 结果与分析

2 1 不同处理对蛇龙珠茎尖复苏的影响

从表1可以看出，处理1、处理2的茎尖复苏培养基茎尖成活率最高，都能达到100%；处理5、处理6、处理7成活率较高，都在90%以上。

由表2可知，处理1、处理5、处理8茎尖复苏培养基茎尖生长情况好，叶片面积大（图1），最终得分都在90分以上。

综合考虑，处理1、处理5茎尖复苏培养基是效果好的葡萄茎尖复苏培养基。

2 2 不同处理对蛇龙珠组培苗生茎的影响

从表3可见，茎尖在处理5复苏培养基上复苏3周后，转入B5（改良）+1 5 mg/L 6-BA+0 1 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂的生茎培养基效果最好：轻度褐化、无明显愈伤、有单株分化、长势好（图2）；其余培养基则表现为愈伤丛芽、严重褐化、长势过弱或死亡。

3 讨论

3 1 茎尖复苏培养基筛选

好的茎尖复苏培养基不仅茎尖成活率要高，而且茎尖应该生长良好、长势旺盛。本研究从茎尖成活率和茎尖生长情况两方面对茎尖复苏培养基进行综合考量，最终选出成活率高、长势旺盛的2种茎尖复苏培养基供后续研究使用。

6-BA是人工合成的植物生长调节剂，具有促进细胞延长、细胞分裂、芽形成等作用。IBA也是人工合成的植物生长调节剂，是IAA的类似物，具有促进不定根形成和根生长的作用。顾沛雯等研究发现，6-BA和IBA在茎尖复苏中是不可缺少的植物生长调节剂，不添加6-BA或不添加IBA都不能诱导茎尖萌发 [7]，只有二者共同使用，才能成功诱导茎尖萌发。Wang等研究发现，在茎尖复苏培养基中添加IBA比添加NAA效果好，有利于不定根的形成 [6，9]。6-BA的浓度大于0 5 mg/L时对小芽的顶端优势有明显抑制作用，会产生大量丛芽；6-BA浓度低于0 5mg/L时有利于小芽的正常生长，不易产生大量丛芽。

本研究根据文献资料采用赋值加权的方式将成功复苏的茎尖的生长情况量化，从而易于比较和分析。本研究以叶片宽度为基本参考，根据复苏2周的茎尖生长情况将叶片宽度分为3类：A类叶片0 8 cm<叶宽≤1 0 cm；B类叶片0 6 cm<叶宽≤0 8 cm；C类叶片0 25 cm<叶宽≤0 6 cm。A类叶片每张赋值1，B类叶片每张赋值0 5，C类叶片每张赋值025。这样，复苏后茎尖的生长情况得以量化，从而为评价其生长状况提供了方法和依据。

3 2 生茎培养基筛选

茎尖复苏培养、生茎培养、生根培养，各阶段的生长调节剂配比有所不同。本研究发现，将1～2 mm的4周龄蛇龙珠葡萄试管苗茎尖接种于B5（改良）+1 5 mg/L 6-BA+0 05 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂的茎尖复苏培养基上，暗培养3 d后，见光正常培养，3周龄时转入B5（改良）+0 3 mg/L 6-BA+0 2 mg/L IAA+30 g/L 蔗糖+7 g/L琼脂的生茎培养基，光照正常培养4周后转入B5（改良）+0 2 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂+ 1 g/L活性炭的生根培养基，最为合适。此方法处理过的蛇龙珠茎尖成活率高、不易褐化、长势良好。

葡萄生茎培养基筛选试验中出现大量的愈伤和丛芽现象，其可能原因是6-BA的浓度偏高或添加了IBA而不是IAA。董晓玲等研究发现，培养基中6-BA浓度偏高会导致小芽难以生长成为较长的幼茎并产生丛芽 [9]。如果培养基中添加IBA而不是IAA则会导致芽丛生长缓慢并且难以生长为较长的幼茎。

参考文献：

[1] 陈泽雄 园艺植物病毒脱毒技术研究进展[J] 北方园艺，2007（5）：58-60

[2]张振臣，李大伟，于嘉林，等 植物病毒细胞间运动及运动蛋白基因介导的抗病性研究进展[J] 农业生物技术学报，2000，8（4）：403-408 [HJ1 5mm]

[3]孙 琦，张春庆 植物脱毒与检测研究进展[J] 山东农业大学学报：自然科学版，2003，34（2）：307-310

[4]曹雪松 植物病毒在细胞内和细胞间运动的研究[J] 莱阳农学院学报，2002，19（4）：251-252

[5]Wang Q C，Panis B，Engelmann F，et al Cryotherapy of shoot tips：a technique for pathogen eradication to produce healthy planting materials and prepare healthy plant genetic resources for cryopreservation[J] Annals of Applied Biology，2009，154（3）：351-363

[6]Wang Q C，Valkonen J P Cryotherapy of shoot tips：novel pathogen eradication method[J] Trends in Plant Science，2009，14（3）：119-122

[7]顾沛雯，洪 波，马永明，等 宁夏玉泉营地区葡萄卷叶病田间自然发病调查及检测[J] 宁夏农学院学报，2001，22（3）：21-23，38

[8]王曼丽，谢满玉，胡秋英 葡萄茎尖培养与腋芽切段快速繁殖技术[J] 湖南农业科学，1992（6）：28-29

[9]董晓玲，李世诚，金佩芳，等 几种激素对葡萄茎尖培养的影响[J] 上海农业科技，1990（3）：38-39