冷处理对尾巨桉几种生理指标和POD基因转录的影响

陈丽敏　陈秋洁　陈美清

摘要：6 ℃冷处理尾巨桉（Eucalyptus urophylla × E. grandis）半年龄树苗24 h后，检测叶片电导率、叶绿素含量、丙二醛含量、可溶性蛋白质含量、SOD活性、POD活性等生理指标的变化，进行POD同工酶电泳，并用实时定量PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR）检测了4个POD基因的转录变化。结果表明，与常温相比，冷处理后尾巨桉的叶绿素含量、可溶性蛋白质含量和SOD活性无明显变化；但相对电导率、丙二醛含量和POD活性都有升高，且与常温下有显著差异。POD同工酶电泳结果显示，冷处理后，L1、L2、L8、L9和L10共5个酶带表达增强；L3、L4、L5、L6、L7共5个酶带的表达明显受到抑制。实时定量PCR检测POD1、POD2、POD3、POD4基因的转录变化发现，低温处理后4个基因的转录明显被抑制，其转录水平分别是常温下的0.21、0.41、0.40和0.21倍。上述结果表明，低温胁迫对尾巨桉的相对电导率、丙二醛含量、POD活性、POD同工酶表达变化和POD基因的转录水平等指标有显著影响，低温下这几个指标的变化幅度可作为筛选耐寒性较强尾巨桉株系的参考。

关键词：尾巨桉（Eucalyptus urophylla × E. grandis）；耐寒性；生理指标；POD基因

中图分类号：S792.39 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）15-3696-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.15.029

Abstract：Several physiology indexes and transcription level of four POD （peroxidase） genes were detected after half-year-old saplings of Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis were treated at 6 ℃ for 24 h. Meanwhile，peroxidase isozymes electrophoresis and transcription levels of 4 peroxidase genes were analyzed. Compared to at room temperature，the content of chlorophyll and soluble protein and SOD activity had no obvious change at 6 ℃.But relative conductivity，MDA content and POD activity increased markedly at low temperature. The expressions of five peroxidase isozymes with medium molecular weights were inhibited， including line3，line4，line5，line6 and line7.The transcriptional levels of POD，POD2，POD3，POD4 gene were detected by the real-time quantitative PCR （qPCR） in which RTEF gene was used as internal reference gene.The results showed that the transcriptional levels of 4 POD genes were significantly inhibited.Normalized transcriptional level of the same genes to one at room temperature，the transcriptional levels of POD1，POD2，POD3 and POD4 genes were 0.21，0.41，0.40 and 0.21，respectively.The results indicated that relative conductivity，MDA content，POD activity，POD isozymes and the transcriptional levels of POD1，POD2，POD3 and POD4 genes could be used as important references to scan eucalyptus strain with cold tolerance.

Key words：Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis；cold tolerance；physiology index；POD gene

桉树原产澳大利亚，是桃金娘科（Myrtaceae）杯果木属（Angophora）、伞房属（Corymbia）和桉属（Eucalyptus）植物的统称，有1 039个种、亚种和变种[1]。桉树生长速度快、轮伐期短、耐干旱、耐瘦瘠、适应性广，且用途广泛，经济效益高，是世界公认的三大人工林树种之一。桉树在中国南亚热带地区已成为主要造林树种，并营造了各类试验林和大面积的速生丰产林基地[2]。随着桉树产业的发展，桉树种植不断北移。在北移的过程中，低温冻害对桉树扩大栽培与速生丰产造成阻碍，桉树个体的抗寒性成为主要限制因子[3]。尾巨桉（Eucalyptus urophylla×E. grandis）是重要的纸浆用材树种，因生长迅速，干形好，已成为中国华南地区人工林的重要树种[4]。但其耐寒性不足严重制约推广栽培。活性氧代谢、保护酶表达和活性变化对桉树生长、分化等生理过程有显著的影响[5，6]。试验通过检测低温处理对尾巨桉几种生理指标和POD基因转录的影响，试图为耐寒性桉树的早期鉴定、引种、育种等提供理论依据和实用的指标。

1 材料与方法

1.1 试验材料

尾巨桉（无性系32-29）半年龄树苗。

1.2 冷处理

将人工气候箱（26±2） ℃中培养的大小一致、长势良好的树苗置于（6±1） ℃，16 h光照/8 h黑暗，光照度为50 μmol/（m2·s） 的人工气候箱中冷处理24 h。剪取近顶芽的第三片完全展开的成熟叶片，依次用自来水、蒸馏水、超纯水冲洗干净，吸去附着的水分后备用。对照组温度为（26±2） ℃，其他条件与处理组相同。

1.3 酶活性及同工酶电泳

称取0.2 g叶片，加入2.0 mL磷酸缓冲液（100 mmol/L pH 6.9）冰浴匀浆，4 ℃，10 000 r/min离心15 min得上清为酶液。用考马斯亮蓝法检测酶液蛋白质浓度[7]。用愈创木酚法检测酶活性，以每分钟ΔA470 nm变化0.01为1个酶活单位。3 mL反应体系：0.25%（V/V）愈创木酚，3 mmol/L H2O2，100 mmol/L pH 6.9磷酸缓冲液，酶液 20 μL。聚丙烯酰胺活性凝胶进行同工酶电泳。上样蛋白质量为10 μg，浓缩胶浓度4%，分离胶浓度8%，浓缩电压2.5 V/cm，分离电压5 V/cm，染色液为2%联苯胺溶液。

1.4 RNA提取和反转录

用打孔器取直径为15 mm的叶盘置于1 mL RNAiso-mate for Plant Tissue中匀浆。再按RNAiso Plus试剂说明书步骤提取总RNA，溶于30 μL RNAase-free H2O。用Nanodrop 2 000 c检测总RNA质量和浓度。在10 μL反应体系中分别加入5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL和总RNA 1 μg，用RNAase-free H2O补齐至10 μL后瞬时离心混匀，30 ℃反应5 min去除残存的DNA。再在上述反应液中加入5×PrimeScript Buffer 4 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1 μL，RT Prime Mix 1 μL和RNAase-free H2O 4 μL，瞬时离心混匀，37℃反应15 min，85℃ 5 s使酶失活，得cDNA保存于 -20 ℃冰箱备用。上述所用试剂均为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.5 目的基因选择及引物设计

检索GenBank，得到AB591334.1和AB591330.1两个桉树POD基因的CDS序列。从The PeroxiBase（http：//peroxibase.toulouse.inra.fr/）数据库所列的巨桉过氧化物酶基因中选择CDS序列完整的EgrPrx08和EgrPrx09。将基因的CDS序列输入primer3plus软件设计qPCR引物。用RTEF基因作内参基因[8]。

1.6 qPCR扩增

取“1.4”所得的cDNA溶液作模板，进行qPCR。反应仪器为Chromo 4TM System（Bio-Rad）。qPCR反应体系25 μL，分别是：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）（2×Conc）12.5 μL，10 μmol/L Primer F 和Primer R各1 μL，ddH2O 8.5 μL，cDNA模板2 μL。扩增程序：94 ℃ 9 s，55 ℃ 9 s，72 ℃ 15 s，延伸后荧光读数，共40个循环。从70～90 ℃，每升高1 ℃ 荧光读数1次，得融链曲线。每个反应3次重复。设常温下基因的表达量为1，采用相对定量的Pfaffl法[9]，计算各基因冷处理后的相对表达值。

2 结果与分析

2.1 冷处理前后尾巨桉生理指标变化

与常温相比，冷处理后尾巨桉的叶绿素含量、可溶性蛋白质含量和SOD活性无明显变化；但相对电导率、丙二醛含量和POD活性都有升高，且与常温下有显著差异，其中相对电导率和POD活性的变化最为明显（表1）。

2.2 冷处理前后尾巨桉叶片POD同工酶电泳结果

从图1可以看出，冷处理后，分子量位于中间的同工酶（L3～L7）表达量降低，分子量较小的同工酶（L8～L10）和分子量较大的同工酶（L1和L2）表达量升高。其中低分子量的同工酶L9的活性增强最为明显。低温处理对不同酶带活性的影响差异明显。

2.3 基因扩增特异性检测结果

将4个POD基因的CDS序列输入primer3plus软件设计qPCR引物。qPCR得到的融链曲线都只有单一的峰，POD1、POD2、POD3和POD4基因扩增产物的融链温度分别是86、87、88和87 ℃，说明扩增特异性好，无引物二聚体产生（表2）。经序列分析，POD1、POD2、POD3和POD4基因扩增产物的长度分别为165、194、179和201 bp。

2.4 冷处理前后POD基因表达变化

设常温下相同基因表达量为1，冷处理后，尾巨桉POD1、POD2、POD3和POD4的表达均显著降低，分别为常温下的0.21、0.41、0.40和0.21倍（图2）。结合同工酶电泳结果分析，POD1、POD2、POD3和POD4基因的表达受低温的抑制类似于L3～L7等酶带活性受低温的抑制。

3 小结与讨论

与耐寒性较弱的树种相比，冷处理后耐寒性较强的树种的可溶性蛋白质含量[10]、叶绿素含量和SOD活性明显升高，相对电导率升高幅度小，丙二醛含量低[11，12]，本试验结果与已报道结果一致。低温处理后，尾巨桉相对电导率、丙二醛含量和POD活性都有升高，且与常温下有显著差异。

冷处理对尾巨桉的POD同工酶表达有明显影响，表明这些酶在低温处理前后发生了质或量的变化。qPCR检测发现，低温处理后尾巨桉POD1、POD2、POD3、POD4基因的转录明显被抑制，其转录水平分别是常温下的0.21、0.41、0.40和0.21倍。究其原因可能是尾巨桉POD酶同工酶谱带较多，各条酶带对低温处理的应答机制不同，且每个同工酶对整体酶活性的影响大小不同。本试验结果表明，低温胁迫对尾巨桉的相对电导率、丙二醛含量、POD活性、POD同工酶表达变化和POD基因的转录水平等指标有显著影响。检测低温处理后这些指标的变化情况可作为筛选耐寒性较强尾巨桉株系的重要参考。

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