一种基于HPLC指纹图谱的贵州凤冈锌硒绿茶区别方法

李霞 谭克刚 任道援等

摘要：参照《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A）建立了基于HPLC的贵州凤冈锌硒茶标准指纹图谱R，并与其他地区的同类样品进行对比分析。结果显示，标准指纹图谱能够反映出贵州凤冈锌硒绿茶HPLC图谱的共性，相似度分析能明显区分凤冈锌硒绿茶样品与参比样品（以相似度0.9进行划分）；系统聚类的方法可以将贵州凤冈锌硒绿茶与参比样品区分，且能反映样品产地区别。散点图能够显示凤冈锌硒绿茶样品与参比样品的区别。结果可为凤冈锌硒绿茶的真伪鉴别、质量评价提供参考。

关键词：凤冈锌硒绿茶；HPLC；指纹图谱

中图分类号：S571.1；O657.7+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）14-3513-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.14.047

Identification Zinc and Selenium Green Tea from Guizhou Fenggang

Based on HPLC Fingerprints

LI Xia， TAN Ke-gang， REN Dao-yuan， FENG Fa-qing， XIANG Li-ping， WANG Ao

（Institute of Product Quality Inspection & Testing of Zunyi， Zunyi 563000， Guizhou， China）

Abstract： According to the standard operating procedure of similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of TCM （Version 2004A）， the standard fingerprint R of zinc and selenium tea from Guizhou Fenggang was established based on HPLC. The results indicated that the standard fingerprint of zinc and selenium tea from Guizhou Fenggang could reflect its internal components in common. Similarity analysis clearly distinguished the zinc and selenium tea from Guizhou Fenggang from the reference samples（divided to similarity of 0.9）；System clustering method could also showed this difference and the sample origin in all samples. Scatter diagram showed a separation of zinc and selenium tea from Guizhou Fenggang in 59 samples. The results provide the reference for identification and quality evaluation of zinc and selenium tea from Guizhou Fenggang.

Key words： zinc and selenium tea from Guizhou Fenggang； HPLC； fingerprint profile

位于贵州遵义的凤冈县是贵州省重要的茶产区之一，其绿茶产品“凤冈锌硒茶”于2006年获得地理标志产品，其特点是同时含锌硒微量元素（其中锌含量40～100 mg/kg，硒含量0.05～2.5 mg/kg），这一方面可提高茶叶中儿茶素的生理活性，增强其抗氧化、抗癌等保健作用[1]，另一方面也可影响茶树生理活动，调控植株对不同物质的吸收-分配-积累[2-5]，影响到茶叶的品质、风味等，进而形成相对独特的指纹图谱[6-8]。

基于高效液相色谱（HPLC）的指纹图谱方法已成为中药研究和鉴定的主要手段[9，10]。通过指纹图谱不但能够全面反映中药内在化学成分的特征和品质，还为其真伪鉴别提供了理论基础[11-13]。目前，茶叶品鉴多依赖感官评定方法，易受评定人员主观经验的限制，采用仪器分析各种品质指标，由于客观且重现性好，是茶叶真伪鉴别、品质评定的发展趋势。本试验以凤冈锌硒茶为对象，运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》建立基于HPLC的标准指纹图谱模型[14，15]，并对模型适用性进行分析评价[16]，以期为凤冈锌硒绿茶的真伪鉴别、品质分析等提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

于2012-2013年，依据凤冈富锌富硒茶地理标志产地所界定的地域范围，在贵州省遵义市凤冈县田坝随机抽取了29个凤冈锌硒绿茶（Fg）样品。所有样品均为独芽、依照凤冈富锌富硒茶加工工艺进行制作，样品经粉碎机粉碎、过20目筛后密封备用。同时，收集了贵州其他地区，且原料、加工工艺与凤冈锌硒绿茶接近的绿茶样品共23个，其来源为：铜仁9个（Tr），都匀5个（Dy），六盘水4个（Lps），湄潭5个（Mt）。所有样品经粉碎机粉碎、过40目筛后密封备用。

1.2 仪器

1260型高效液相色谱仪（Agilent，美国）配备二极管阵列检测器。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理 分别称取样品0.250 0 g，加70%（V/V）甲醇20.0 mL，经超声处理30 min后，0.45 μm滤膜过滤，待测。

1.3.2 液相条件 色谱柱为Zorbax Eclipse Plus C18 栓（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A），0.3%（V/V）冰乙酸（B），梯度洗脱（0 min 5%A，3 min 5%A，4 min 14%A，21 min 14%A，26 min 15%A，34 min 15%A，40 min 17%A，45 min 25%A，55 min 25% A，V/V）；流速0.5 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL；检测波长365 nm。

1.3.3 结果计算 采用SPSS 13.0统计分析数据，用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版作图。

2 结果与分析

2.1 标准指纹图谱模型R

在《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版中，按80%以上样品共有峰为样品集共有峰；参考中药色谱指纹图谱构建方法，以峰面积相对较大的13号峰为参照峰S，生成共有模式作为凤冈锌硒绿茶HPLC标准指纹图谱模型R，如图1所示。由图1可知，样品的HPLC色谱峰基线平稳、色谱峰峰形、分离效果均较好，且不同样品间有明显的共有峰。

2.2 相似度分析

相似度作为指纹图谱评价的一个参数，已被国家药典委员会确定为中药指纹图谱标准中的一项重要评价指标。相似度的计算主要采用相关系数法及向量夹角余弦法。以凤冈锌硒绿茶标准指纹图谱作为对照，以参比样品色谱峰的相对保留时间和峰面积为因子，利用SPSS软件计算52批贵州不同产地绿茶样品HPLC数字化指纹图谱的相关系数和向量夹角余弦，结果如表1所示。

由表1可知，利用相关系数及夹角余弦2种方式计算出的指纹图谱的相似度均可以表示图谱间的相似性。贵州凤冈锌硒绿茶HPLC对照指纹图谱与29批贵州凤冈锌硒绿茶标准指纹图谱R相似度均大于0.9，与六盘水、都匀、湄潭、铜仁等贵州其他产地绿茶相似度均小于0.9，相似度结果容易将贵州凤冈锌硒绿茶与贵州其他产地绿茶区分开来。

2.3 聚类分析

在相似度分析的基础上，利用SPSS软件对52个贵州绿茶样品HPLC数字化指纹图谱的全部成分进行系统聚类。选用欧氏距离作为样品间相似性的测度，采用质心聚类法聚类分析，结果如图2。由图2可知，52个样品系统聚类的结果可分为2大类：Mt1～5号、Dy1～5号、Tr1～9号和Lps3～4号绿茶为第1大类，其与贵州凤冈锌硒绿茶HPLC对照指纹图谱相关系数和夹角余弦均小于0.8；第1大类又可分为2小类，Tr1～5、Tr8～9、Dy5、Mt4号绿茶为1小类，除Dy5、Mt4号外均采自贵州铜仁绿茶；Dy1～4、Tr6～7、Mt1～3、Mt5、Lps3～4号绿茶为2小类。Fg1～29号绿茶和Lps1～2号绿茶分为第2大类，其与贵州凤冈锌硒绿茶HPLC对照指纹图谱相关系数和夹角余弦均大于0.8，且Fg1～29号绿茶与贵州凤冈锌硒绿茶HPLC对照指纹图谱相关系数和夹角余弦均大于0.9；除Lps1～2号绿茶采自六盘水外其余绿茶均采自贵州凤冈。经考察，Lps1～2号样品种源来自贵州凤冈，造成相似度大的原因可能是种源的因素。通过以上分析可知，利用系统聚类方法很容易将贵州凤冈锌硒绿茶与贵州其他地区绿茶区分开来，且可以对贵州不同产地绿茶进行归类。

2.4 主成分及二维排序分析

利用SPSS软件的主成分分析函数分析52个样品，结果见表2和表3。通过对主成分贡献的分析可知，由于茶叶内含成分较多，对茶叶品质的影响因素不是单一的，此色谱条件下测定的贵州绿茶指纹图谱茶叶主成分达到了3个。PC1～PC3的贡献率分别为69.621%、13.001%、6.9765%，累计贡献率为89.587%，其他成分的贡献率相对较小，从累计贡献率来看，根据主成分分析原理，取前3个为主要成分足可以说明各指标信息。由特征向量表（表3）可以看出，PC1主要反映了原始图谱的3号、5号、8号和13号色谱峰的信息，PC2主要反映了原始图谱的6号、7号、10号和15号色谱峰的信息。

以52个样品的第1主成分作纵坐标，以第2主成分为横坐标，利用SIMCA-P+12软件作成散点图（图3），由散点图可以直观显示出贵州凤冈锌硒绿茶样品与贵州其他产地绿茶样品不同。Fg1～29号绿茶均采自贵州凤冈，品质相近，在散点图上基本聚在一起，且与采自贵州其他产地的绿茶在散点图上相距较远。贵州其他产地的绿茶除Lps1～2号、Dy5号及Mt4号绿茶外，在散点图上也基本聚集在一起。

3 小结

以HPLC为基础，用二极管阵列检测器（DAD）在365 nm处分析，能够获得凤冈锌硒茶样品内含物特征及其与参比样品的差异。经方法基线平稳，且总体峰面积较大，操作简单、重复性好。相似度分析、聚类分析、主成分均显示所建立的凤冈锌硒绿茶标准指纹图谱R有相对独特的特征，可为相关研究提供参考。

参考文献：

[1] 赵保路.茶多酚的抗氧化作用[J].科学通报，2002，47（16）：1206-1210.

[2] 王小平，刘 鹏，罗 虹，等.铝氟交互处理对茶叶品质的影响[J].茶叶科学，2009，29（1）：9-14.

[3] 王小平，刘 鹏，罗 虹，等.铝氟交互处理对茶树生理特性的影响[J].园艺学报，2009，36（9）：1359-1364.

[4] 夏建国，兰海霞，吴德勇.铅胁迫对茶树生长及叶片生理指标的影响[J].农业环境科学学报，2010，29（1）：43-48.

[5] 唐 茜，赵先明，杜 晓，等.氟对茶树生长、叶片生理生化指标与茶叶品质的影响[J].植物营养与肥料学报，2011，17（1）：186-194.

[6] 王丽鸳，成 浩，周 健，等.绿茶数字化多元化学指纹图谱建立初探[J].茶叶科学，2007，27（4）：335-342.

[7] 成 浩，王丽鸳，周 健，等.基于化学指纹图谱的绿茶原料品种判别分析[J].中国农业科学，2008，41（8）：2413-2418.

[8] 杨晓莉，王聪慧，李菊华，等.HPLC法测定不同年份下关沱茶咖啡因的含量[J].安徽农业科学，2010，38（31）：17463-17464.

[9] 沙 明，王嘉仡，曹爱民，等.HPLC指纹谱技术在中药新药质量控制中的应用[J].中草药，2002，33（2）：87-89.

[10] 沙 明，张东方，孟宪生，等.DNA指纹谱与HPLC指纹谱对中药地榆质量评价研究[J].中国药学杂志，2002，37（11）：15-18.

[11] 陈闽军，瞿海斌，程翼宇.一类用化学指纹特征鉴别中药材真伪的方法[J].高等学校化学学报，2003，24（12）：2181-2185.

[12] 陈闽军，吴永江，范骁晖，等.色谱指纹图谱分析技术用于鉴别中药川芎产地[J].中国中药杂志，2003，28（7）：23-27.

[13] 陶金华，狄留庆，文红梅，等.中药指纹图谱谱效相关性研究思路探讨[J].中国中药杂志，2009，34（18）：2410-2413.

[14] 程翼宇，陈闽军，吴永江.化学指纹图谱的相似性测度及其评价方法[J].化学学报，2002，60（11）：2017-2021.

[15] 冯启余，曹玉华，龚立冬.中药指纹图谱共有峰的自动识别[J].分析科学学报，2009，25（1）：41-46.

[16] 陈全胜，赵杰文，张海东，等.SIMCA模式识别方法在近红外光谱识别茶叶中的应用[J].食品科学，2006，27（4）：186-189.