过塘蛇药材中没食子酸含量分析

李兵 陈建惠 卢汝梅等

摘要：为研究过塘蛇（Jussiaea repens L.）药材的质量控制技术，分别采用薄层色谱和液相色谱法分析了过塘蛇样品中活性成分没食子酸含量。结果表明，薄层色谱法可半定量分析其没食子酸含量，液相色谱法可定量分析没食子酸，其进样量在0.12～0.86 μg之间，与峰面积呈良好线性关系（r=0.999 9），平均回收率为97.87%（RSD=0.70%，n=6），10份样品中的没食子酸含量为0.48～2.21 mg/g。该方法简单可行、重现性好，可用于过塘蛇药材的质量控制。

关键词：过塘蛇（Jussiaea repens L.）；没食子酸；药材质量；薄层色谱；液相色谱

中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）14-3508-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.14.045

Analysis of Gallic Acid in the Medical Material of Jussiaea repens L.

LI Bing1，CHEN Jian-hui1，LU Ru-mei1，NONG Mei-dong1，ZHONG Jiang2

（1.Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning， 530200；

2.The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning， 530012）

Abstract： The content of gallic acid in Jussiaea repens L. was analyzed by thin layer chromatography （TLC） and high performance liquid chromatography （HPLC） which provided an index of evaluation for this medical material quality. The results showed that TLC was a good semi-quantitative analysis for detecting gallic acid in this medical material， and HPLC had a good performance on quantitative analysis gallic acid. In the HPLC analysis， the good linearity in the range of 0.12～0.86 μg （r=0.999 9） was obtained. The average recovery reached 97.87% （RSD=0.70%，n=6），the contents of gallic acid in 10 samples were in the range of 0.48～2.21 mg/g. The methods are simple， feasible，repeatable for analyzing this medical material quality.

Key words： Jussiaea repens L.； gallic acid； medical material quality； TLC； HPLC

过塘蛇（Jussiaea repens L.）是柳叶菜科水龙属植物水龙，主要分布于广西、浙江、江西、广东等地，曾收载于《广西中药材标准》，为多种中成药的原料药[1]。其味淡，性凉，以干燥全草入药，具有清热、解毒、利尿、消肿之功效，常用于治疗感冒发烧、燥热咳嗽、水肿、喉痛、风火牙痛等症[2]。目前国内外对过塘蛇研究较少，Marzouk等[3]发现过塘蛇中广寄生苷的酰化产物具有保肝护肝、抗炎、治疗糖尿病的作用。张尊听等[4]采用分光光度法测定秦岭太白山20种中草药的乙醇提取液对DPPH·（1，1-二苯基-2-苦肼基自由基）的清除作用，发现过塘蛇浓度为0.4 mg（干重）/mL时，对DPPH·的清除作用高达84.1%，抗氧化作用最强。没食子酸单体经研究表明具有抗氧化[5]、抗肿瘤[6，7]、抗乙肝病毒[8]、降糖降脂[9]等多种生物学活性。因此，本文采用薄层色谱法对过塘蛇药材进行定性鉴别，并采用 HPLC 法测定过塘蛇药材中指标成分没食子酸的含量，为过塘蛇药材的制剂开发和质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

10批过塘蛇药材均采收于广西不同市县，经广西中医药大学韦松基教授鉴定为柳叶菜科水龙属植物水龙（Jussiaea repens L.）。

没食子酸对照品购于中国食品药品检定研究院（批号110831-201204），甲醇（色谱纯）购于西陇化工股份有限公司，其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津）

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液的制备 称取没食子酸对照品适量，加甲醇制成1 mg/mL对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液的制备 取样品粗粉过二号筛，称取粉末2.0 g，置于锥形瓶中，加甲醇50 mL，超声提取30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加入适量甲醇溶解，作为薄层色谱供试品溶液；称取样品粉末约2.000 0 g置于圆底烧瓶中，加入32 mL水，称定重量，加热回流提取1 h，放冷，再称定重量，用水补足损失的重量，摇匀，滤过。回流提取3次，合并提取液，滤过，收集滤液，待HPLC分析。

1.3.3 薄层色谱分析 吸取对照品溶液和10批不同产地的药材样品溶液适量，分别点于高效薄层硅胶G板，以乙酸乙酯-氯仿-甲酸（5∶4∶1，V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷5%的磷钼酸乙醇液，在 105 ℃加热至斑点显色清晰。

1.3.4 HPLC分析 Cosmosil C18柱（5C18-PAQ，4.6 mm×250 mm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸（8∶92，V/V）；检测波长270 nm，流速1.0 mL/min，柱温为室温。理论塔板数按没食子酸计算应不少于5 000。

2 结果与分析

2.1 薄层色谱分析

样品的薄层色谱图见图1。由图1可知，样品与对照品色谱相应的位置（Rf=0.5）上，显相同颜色的斑点，重现性较好。

2.2 高效液相色谱分析

标准品和样品的HPLC色谱图见图2。由图2可知，对照品溶液和供试品溶液在相同的时间内有对应的吸收峰，且峰型对称，无杂峰干扰，理论塔板数按没食子酸计算不少于5 000，表明该方法可用于过塘蛇中的没食子酸含量分析。

2.2.1 方法学分析 分别吸取对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、14.0 μL，注入高效液相色谱仪测定，以对照品进样量（μg）为横坐标，对应峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=3E+06x-7 444.7（r=0.999 9），结果表明没食子酸进样量在0.12～0.86 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

吸取没食子酸对照品溶液（61.2 μg/mL）10 μL，重复进样6次，测定峰面积，计算峰面积的RSD为0.48%（n=6），表明精密度良好。

取同一批号药材（产地为贺州）6份，每份约2 g，按上述方法制备供试品溶液并进行液相色谱分析。结果表明，没食子酸的平均含量为1.38 mg/g（RSD=2.99%，n=6），方法重复性良好。

取同一批号药材（产地为贺州）2 g，按上述方法制备供试品溶液，常温分别放置0、2、4、8、12和24 h后，进行液相色谱分析。结果表明，没食子酸峰面积的RSD为0.56%（n=6），即供试品溶液在24 h内稳定。

取同一批号药材（产地贺州）约1 g，再分别加入浓度为1.53 mg/mL（已按干燥品折算）的没食子酸对照品溶液1 mL，同上法处理并计算加样回收率。结果表明，没食子酸平均回收率为97.87%（RSD=0.73%，n=6，已按干燥品折算），即该法较为准确可靠。

2.2.2 不同产地过塘蛇中没食子酸含量的测定 将样品按照上述方法处理，每样品设3份平行，经液相色谱分析，外标法计算没食子酸含量，结果见表1。由表1可知，各产地中过塘蛇中的没食子酸含量为0.48～2.21 mg/g。

3 讨论

在制备供试品溶液时，考察了水、无水甲醇和无水乙醇等提取溶剂对结果的影响，也比较了超声、回流和冷浸提取的效果，同时还考察了溶剂倍数对指标成分的影响，结果表明，以水为溶剂，采取回流提取，提取3次，没食子酸的提取率较高。试验同时考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液等流动相对结果的影响，发现以甲醇-0.1%磷酸水溶液（8∶92，V/V）为流动相时，保留时间适中，分离度大于1.5，故采用此溶液作为流动相。

该方法快速、准确、灵敏度高、重现性好，对过塘蛇药材的质量控制和进一步制剂研究开发具有参考价值。

参考文献：

[1] 广西壮族自治区卫生局.广西本草选编（上册）[M].南宁：广西人民出版社，1974.2721.

[2] 广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准[M].南宁：广西科学技术出版社，1992.1911.

[3] MARZOUK M S，SOLIMAN F M，SHEHATA I A，et al.Flavonoids and biological activities of Jussiaea repens[J]. Natural Product Research，2007，21（5）：436-43.

[4] 张尊听，贺 云，刘谦光，等.分光光度法测定太白山20种中草药的抗氧化活性[J].分析试验室，2002，21（2）：50-52.

[5] 张建平，易 醒，肖小年，等.泽泻提取物自由基清除能力的研究[J].时珍国医国药，2009，20（5）：1181-1182.

[6] 李沐涵，殷美琦，冯靖涵，等.没食子酸抗肿瘤作用研究进展[J]. 中医药信息，2011，28（1）：109-111.

[7] 何文飞，何大维，马 超，等.没食子酸抑制人神经母细胞瘤增殖作用的实验研究[J].第三军医大学学报，2011，33（2）：107-110.

[8] 郑民实，孔庚星，张 鑫，等.没食子酸抗HBsAg/HBeAg的实验研究[J].实用中医药杂志，1998，14（1）：5-7.

[9] 张冬英，邵宛芳，刘仲华，等.普洱茶化学成分及对α-淀粉酶抑制作用的研究[J].西南农业学报，2009，22（1）：52-54.