微生物降解枸杞中啶虫脒农药残留技术的安全性评价

刘畅 郭进 刘敦华

摘要：从长期种植枸杞（Lycium barbarum L.）的土壤中分离筛选出一株可高效降解农药啶虫脒的细菌AC04，并制备成有效菌含量≥108 CFU/g的菌制剂。通过毒理学试验对菌制剂的安全性进行分析，对小鼠进行菌液经口灌胃试验、皮肤致敏试验和大鼠30 d喂养试验。结果表明，经口灌胃试验小鼠的行为和进食均正常，受试物对小鼠无急性致毒作用。皮肤致敏试验中试验组小鼠致敏率为0，阳性对照组（给予2，4-二硝基氯苯）小鼠致敏率为100%，说明该菌制剂无皮肤致敏性。大鼠30 d喂养试验中，试验动物各项指标均正常，无明显的中毒症状或不良反应，说明该菌制剂及其代谢产物对环境及人体无危害，可广泛应用于果蔬等的农药安全控制。

关键词：微生物降解；啶虫脒；枸杞（Lycium barbarum L.）；安全性评价

中图分类号：S567；TQ450.26 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）14-3394-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.14.016

Safety Evaluation on Degradation of Acetamiprid in Wolfberry by Microbiological Agents

LIU Chang， GUO Jin， LIU Dun-hua

（Institute of Agriculture，Ningxia University，Yinchuan 750021，China）

Abstract：Adopted the approach of microorganism degrading acetamiprid in wolfberry. A kind of bacterium AC04 was sifted from the soil that was used long for planting wolfberry and made into microbiological agents，effective bacteria content was more than 108 cfu/g. The safety of the bacterium was tested by toxicology experiment. Intragastric administration was taken through mouse mouths. Sensitization of skin for mice was carried out. Rats were fed by the bacterium for thirty days. The results showed that， the lavaging experiment， mouses behavior and diet were all normal， indicated that the bacterium had no actue virulence for mice.In the skin sensitization test， the sensitization rate of mice was 0 in the experimental group and the rate was 100% on the positive control group， which indicated that the bacterium did not lead to skin sensitization. In the experiment of feeding the bacterium for thirty days， each index was normal and there was no obvious toxicity symptom or side effect. This illustrated that the the bacterium was harmless to the environment and human beings and could be applied to acetamiprid control.

Key words： microbiological degradation；acetamiprid；wolfberry（Lycium barbarum L.）；safety evaluation

随着农田生态系统的变化，宁夏栽培枸杞的主要病虫害也不断发生演变，化学防治所用农药和使用方法也随之不断更新，对生态环境产生了一定的不利影响。以生物修复为理论基础的农药残留降解菌技术就成了降低枸杞和其生产环境中农药残留的一种重要手段。

本研究采用富集培养的方法，对取自宁夏长期种植枸杞土壤中的土著菌进行培养驯化，分离筛选出可降解啶虫脒农药的优势菌种，并制备成有效菌含量≥108 CFU/g的菌制剂。本研究从长期种植枸杞的土壤中分离出一株巨大芽孢杆菌，对农药啶虫脒的降解率达到81%。与此同时，因为某些芽孢杆菌是条件致病菌，为了确保其安全性，并使菌株得到进一步应用，有必要对其进行毒理学研究。本试验以菌悬液为受试物，对小鼠进行经口灌胃染毒试验、皮肤致敏试验、大鼠30 d喂养试验，观测动物给药后所产生的毒性症状及程度、出现和消失的时间、死亡发生率、血象指标和血液生化指标，为该菌株的广泛应用和保证食品的食用安全性提供一定依据。

1 试验材料与仪器

1.1 受试动物

清洁级昆明种小鼠，四周龄，体重（18±2） g，雌雄各半；清洁级大鼠，四周龄，体重（75±2） g，雌雄各半。试验动物均由宁夏医科大学医学动物试验中心提供。

1.2 试剂及仪器

主要试剂：硫化钠、2，4-二硝基氯苯、EDTA盐均为分析纯；糖化血红蛋白检测试剂盒购自威特曼生物科技（南京）有限公司。

主要仪器：AIRTECH型超净工作台（苏净集团安泰公司）；MOL-300型全自动生化分析仪（上海艾诺电子有限公司）；SYSmesXT-1800i型全自动血球计数仪（日本希思曼公司）。

2 试验方法

2.1 受试物样品制备

称取5 g菌制剂溶于500 mL去离子水中，30 ℃、200 r/min摇床培养60 min，其浓度为0.01 g/mL。

2.2 动物分组与饲养环境

试验鼠适应性培养2～5 d，以了解其健康状况和正常活动情况。试验过程中保持受试环境温度20～25 ℃，相对湿度为50%～60%，动物自由摄食和饮水。

2.3 经口灌胃染毒试验

清洁级小鼠20只，雌雄各半，隔夜禁食16 h，不限制饮水。受试物组小鼠按最大灌胃量40 mL/kg·bw于1日内分2 次灌胃，对照组灌给等量生理盐水，一次性给药，然后恢复常规饮食，7 d内测定小鼠致死量并观察小鼠以下指标：行为活动（包括不正常叫声、烦躁、窜跑、少动等）；神经系统反应（竖毛、流泪、流涕、扭体等）；肠胃反应（腹泻腹部胀气或收缩大便性状和色泽等）；皮肤颜色（充血、苍白、发疹等）；眼（瞳孔是否缩小或放大，有无眼球突出，眼睑下垂等）；呼吸（呼吸状态，有无鼻分泌物等）；其他（体重变化，死亡快慢等）。

2.4 皮肤致敏试验

将皮肤无损伤的小鼠随机分为4组，每组10只，雌雄各半，试验前24 h用6%的硫化钠溶液[1]将小鼠腹部脱毛，暴露2 cm2皮肤，不损伤表皮。第一组小鼠给予降解农药用量的一倍浓度；第二组小鼠给予降解农药用量的两倍浓度；第三组小鼠给予无菌生理盐水作空白对照；第四组小鼠给予阳性致敏物（1%的2，4-二硝基氯苯），作为阳性对照。将各组处理液2 mL均匀涂于小鼠腹部皮肤上，然后用一层无刺激油纸覆盖，再用无刺激胶带固定，作用24 h后用温水清洗敷贴部位皮肤，分别于1、24、48、72 h至7 d内观察小鼠皮肤过敏反应情况。参照文献[2]的皮肤刺激性反应评分标准及皮肤刺激性强度评价标准对观察结果进行评分。

2.5 大鼠30 d喂养试验

清洁级大鼠40只，雌雄各半，随机分为4组，3组为受试物组，1组为对照组。3组受试物组分别为低剂量组（10 mL/kg·bw）、中剂量组（20 mL/kg·bw）和高剂量组（30 mL/kg·bw），每组称取枸杞500 g，将受试物或去离子水分别喷洒于枸杞表面，无菌环境下静置24 h待用。大鼠单笼饲养，将处理后的枸杞掺入4 kg饲料内，搅拌均匀后经饲料机制成颗粒状，分别给4组动物饲喂，并自由摄食摄水，观察大鼠是否出现异常行为，每周称重1次，连续观察30 d。喂养试验末期，禁食12 h后颈椎拉断法处死，心脏采血进行血象和血液生化检查；将肝、脾、肾、睾丸取出，并剔除表面脂肪膜，称量肝、肾、脾及睾丸的重量，计算脏体比，并进行病理组织学检查。

2.6 大鼠血象指标测定

取加入EDTA抗凝血剂的血液于血液分析仪中测定试验末期的常规血液指标，即红细胞、血红蛋白和白细胞。

2.7 血液生化指标测定

将非抗凝血5 000 r/min离心15 min，得血清，用SYSmesXT-1800i型全自动生化分析仪检测谷草转氨酶、谷丙转氨酶、白蛋白、总蛋白、肌酐、总胆固醇、尿素氮、血糖、甘油三酯等生化指标。

3 结果与分析

3.1 经口灌胃染毒试验结果

在观察期内，受试物组和对照组小鼠各指标均正常，无明显的中毒症状或不良反应，均无小鼠死亡。

3.2 皮肤致敏试验结果

试验组与对照组在诱发接触期间皮肤刺激反应积分均为0，皮肤刺激反应平均值为0，致敏率为0，结果显示该菌制剂对小鼠不产生皮肤变态反应，无致敏作用。阳性对照组动物在诱导接触期间皮肤刺激反应积分均≥2分，皮肤刺激反应平均值分别为2、2、3、3、4、6、7、7分，致敏率为100%，结果显示2，4-二硝基氯苯为极强致敏物，对受试小鼠皮肤有致敏作用，说明采用的试验系统可靠[3，4]。

3.3 大鼠30 d喂养试验结果

3.3.1 大鼠体征外观、行为及体重的变化 体征外观方面，大鼠食用含菌制剂的饲料30 d后，口周、鼻及尾部黏膜无溃疡，呼吸平稳，背毛有光泽，眼睛红亮，生长发育情况一切正常。行为方面，大鼠活动正常，摄食、饮水、呼吸、大小便均未见异常，亦未观察到受试大鼠明显异常行为和中毒症状。体重方面，大鼠服用受试物30 d后，体重变化见表1。由表1可知，大鼠连续食用含受试物的枸杞30 d，各剂量组大鼠体重不断变化，每周体重较前一周均有所增长，呈现正常增长趋势，组内自身对照各时段的体重差异具有统计学意义；组间对照，即高、中、低三个剂量组与正常对照组相比，各时段体重增长均无明显差异，表明该菌悬液对机体生长无不良影响[5-7]。

3.3.2 血象指标 由表2可知，高、中、低3个剂量组小鼠血液学指标与对照组相比均无显著性差异且指标正常，表明各剂量组对小鼠的血液学指标无明显影响。

3.3.3 血液生化指标 由表3可知，所测各组大鼠末期生化指标谷草转氨酶、谷丙转氨酶、总蛋白、白蛋白、肌酐、尿素氮、甘油三酯、总胆固醇、血糖等与对照组均无显著性差异，表明各剂量组菌制剂对小鼠的血液生化指标均无明显影响。

3.3.4 大鼠脏器质量及脏体比 大鼠主要脏器质量及系数测定结果见表4和表5，由表4可知，对照组及低、中、高3个剂量组的大鼠肝、脾、肾、睾丸均未发生异常。由各试验组重要脏器系数（脏器湿重/体重×100%）结果（表5）可知，各剂量组脏器系数与对照组相比无显著性差异。

3.3.5 病理组织学检查[6，8，9] 大鼠解剖时，观察脏器肝、胃、肾、脾、十二指肠、睾丸、卵巢的色泽、形态、位置均无异常，脏器间无黏连、脏器表面及消化管内膜无充血、瘀血、水肿、溃疡现象，其腹腔、胸腔与对照组相比无肉眼可见病变。

解剖后取出各脏器进一步观察，各剂量组大鼠肾、肝、脾脏、睾丸与对照组基本一致，外观为淡紫红色，表面光泽油润，各脏器组织结构均无异常改变。因此无需做进一步的组织切片观察。综上所述，各剂量组对动物脏器均未产生明显影响或引起损害性改变。

4 结论

本研究中，该受试物对小鼠急性经口最大耐受剂量大于高剂量组，给药期间小鼠无一死亡，外观、行为、呼吸、摄食、粪便均无异常。急性皮肤刺激试验的受试小鼠在诱导接触期均未出现红斑和红肿，致敏性为0，表明菌制剂无刺激性。大鼠30 d喂养试验结果表明，试验期间各剂量组大鼠均未见异常症状和体征，无死亡，大鼠体态健康、血液生化指标无异常变化，各指标测定结果均在正常范围内，大鼠病理组织学检查结果未见异常，表明菌制剂喷洒于枸杞表面后其代谢物无毒性。由此可知，该菌株及代谢产物对环境及人体无危害，可广泛应用于果蔬等的农药安全控制。

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