氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸钠致肠炎相关性结直肠癌小鼠模型的建立

张悦，田洁，田新宇，汤新逸，杨珺，耿丽娜，马洁，许化溪，王胜军（江苏大学检验医学研究所，江苏 镇江 212013）

氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸钠致肠炎相关性结直肠癌小鼠模型的建立

张悦，田洁，田新宇，汤新逸，杨珺，耿丽娜，马洁，许化溪，王胜军
（江苏大学检验医学研究所，江苏 镇江 212013）

目的：建立肠炎相关性结直肠癌的小鼠模型。方法：给予小鼠单次小剂量腹腔注射氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）联合2％葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulpate，DSS）自由饮用，建立肠炎相关性结直肠癌小鼠模型。对照组小鼠给予 PBS腹腔注射后普通饮水。每天观察症状，2％DSS 5 d，普通饮水16 d，此21 d为1个循环，共进行4个循环，结束后，断颈处死小鼠，取脾脏、肠系膜淋巴结、结肠，观察并比较两组小鼠脾脏，肠系膜淋巴结大体改变和结肠 HE染色情况。结果：与对照组比较，实验组小鼠脾脏、肠系膜淋巴结明显增大，结肠远端出现肿瘤。HE染色结果显示，实验组发病小鼠结肠黏膜层及黏膜下层出现广泛的炎症细胞浸润，腺体组织结构紊乱、破坏，出现腺管样结构，具有组织异型性。结论:单剂量 AOM与 DSS联合使用可在短期内诱导小鼠结肠肿瘤的发生。

氧化偶氮甲烷；葡聚糖硫酸钠；结肠癌；动物模型

［Abstract］Objective:To establish a mice model of colitis associated cancer.Methods:The colitis associated cancer was induced by a single intraperitoneal injection of 12.5 mg/kg azoxymethane（AOM）and stepped by four cycles oral administration of 2％dextran sodium sulpate（DSS）.The occult blood was observed everyday.At the end of the fouth cycle，the mice were killed for observing the spleen，mesenteric lymph nodes，colon；colon tissues were harvested for mucosa morphological changes under light microscopy.Results:Compared to the control group，the spleens，mesenteric lymph nodes were enlarged and the tumorigenesis was found in distal colon in the experiment group；and there were a lot of inflammation cell infiltration and dysplasia in colon.Conclusion:Administration of AOM combined with DSS could induce a mice model of colorectal cancer in a short period.

［Key words］azoxymethane；dextran sodium sulpate；colorectal cancer；animal model

炎症性肠病与结直肠癌密切相关［1］。虽然只有1％～2％直结肠癌患者是由炎症性肠病发展而来，但炎性肠病迁延30年后超过18％的患者会发展为结直肠癌，是导致炎性肠病患者死亡的常见原因［2］。尽管近几年结直肠癌的临床研究有了较大的进展，但对于其发病机制仍不清楚，需要进一步深入研究，为此，建立合适的动物模型是必不可少的。氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）是一种用于建立啮齿类动物模型常用的致癌剂，其作用机制主要为烷化 DNA造成碱基错配进而导致癌症的发生［3-4］；葡聚糖硫酸钠 （dextran sodium sulpate，DSS）作为一种促炎药物，溶解于小鼠的饮水中，可引发严重的以血性腹泻为主要特征的肠炎［5］，长期反复接触可发生慢性肠炎。本研究应用小剂量特异的结肠致癌剂 AOM联合 DSS建立肠炎相关的结直肠癌小鼠模型，通过观察相关症状和结肠病理切片来研究小鼠结直肠疾病的发展［6］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验小鼠 12只雄性C57BL/6小鼠，6周龄，体质量 20克（扬州大学实验动物比较中心）。动物合格证号:SCXR（苏）2007-0001。

1.1.2 主要试剂 AOM购自美国 Sigma公司，DSS购自美国MP Bio公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 12只实验小鼠随机均分为对照组（6只）和实验组（6只）。实验组腹腔注射12.5 mg/kg AOM并给予2％DSS水溶液自由饮用5 d；继以普通饮水，16 d。此21 d为1个循环，共进行4个循环。对照组给予 PBS腹腔注射后普通饮水。造模中第27，48，69，90天为第1至第4个循环的最后一天。

1.2.2 结肠炎临床观察 整个实验过程中每个循环的最后一天测体质量；2％DSS开始饮用时至饮用结束当天及开始普通饮水 7 d后，每天观察是否存在肉眼可见血便，检测粪便是否出现隐血。

1.2.3 病理检查 在造模第4个循环结束后，小鼠断颈处死，取脾脏及肠系膜淋巴结，分离肛门至回盲部连接处整段大肠。量取大肠长度，垂直剖开后生理盐水冲洗。肉眼观察后浸入10％甲醛缓冲液固定（pH=7.2）。常规脱水，石蜡包埋，4 μm切片，HE染色，读片。

1.3 统计学方法

所有数据用 SPSS 11.5进行统计分析，两组间均数比较采用独立样本 t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠粪便隐血及体质量的变化

实验组小鼠于腹腔注射AOM后第1次饮用2％DSS水溶液后第 5天，67％（4/6）出现隐血或肉眼血便，在随后正常饮水的第12天隐血症状消失；在第2，3，4个循环中饮用 2％DSS后分别有 67％ 4/6），50％（3/6），33％（2/6）小鼠出现隐血或肉眼血便。

在第1至第4个循环的最后一天（即第27，28，69，90天），称量两组小鼠体质量。结果显示，实验组小鼠体质量增加较对照组缓慢，平均体质量低于对照组。见图1。

图1 两组小鼠体质量变化

2.2 小鼠结肠、脾脏及肠系膜淋巴结大体形态

与对照组比较，实验组小鼠在结肠远端可观察到诱发的肿瘤，肠壁明显变厚，脾脏及肠系膜淋巴结明显肿大。见图2。

图2 两组小鼠结肠、肠系膜淋巴结及脾脏大体形态

2.3 小鼠结肠组织学改变

对照组小鼠腺体排列整齐，实验组 82％（5/6）小鼠结肠黏膜层及黏膜下层出现广泛的炎症细胞浸润，癌组织侵入黏膜层，腺体组织结构紊乱、破坏，出现腺管样结构，具有组织异型性。见图3。

3 讨论

图3 两组小鼠结肠组织 HE染色结果（×10）

啮齿动物模型可模拟结直肠癌的多种特征，是研究结直肠癌的发生发展潜在机制的重要手段［6］；同时，也是研究临床预试验和新治疗方法不可缺少的工具。AOM诱导出肿瘤的高发部位位于结肠远端，与人类结直肠癌的发病特点相似。在此模型中，DSS起到促炎症反应作用；啮齿类动物饮用 DSS水溶液可产生肠上皮毒性，表现为以血性腹泻为特征的肠炎。DSS的剂量选择也是造模成功与否的关键因素之一，过高会导致小鼠在造模过程中大量死亡，而过低则无法诱导出肠癌。本实验采用2％DSS对于结直肠癌模型的建立较为合适。

本研究给予小鼠单次小剂量腹腔注射 AOM联合4个循环 2％DSS自由饮用建立溃疡性结肠炎相关性大肠癌小鼠模型，共90 d，期间观察小鼠相关症状的变化。实验组小鼠与对照组小鼠相比，体质量增加缓慢，到了循环后期差距越来越明显，此为实验组小鼠发生早期的肠炎与后期所发展的肠癌带来的后果。通过对小鼠在疾病发展过程中隐血及肉眼便血的动态观察可以发现，实验组小鼠前 2个循环中急性肠炎的症状突出，在第4个循环结束时，结肠远端出现肉眼可见的肿瘤，呈典型的腺癌样结构。虽然其他诱癌剂也可用于建立该模型，如二甲肼，但AOM具有溶解剂型的稳定性优势，且诱导结肠癌的重复性好［7-8］。以 AOM联用1个DSS循环可模拟急性肠炎诱发的肠癌［9-10］。而本研究中采用AOM联用4个 DSS循环，由于 DSS的反复刺激造成慢性肠炎，故诱导出慢性肠炎相关性肠癌。AOM联用4个DSS循环与联用1个DSS循环相比，产生的肿瘤更高发，且肿瘤生长速度更快［9，11］。

综上所述，本研究中AOM联用 DSS诱导的肠炎相关性结直肠癌动物模型与人类结直肠癌在症状和病理变化上高度相似，且方法简单，实验动物易获得，不仅可用于疾病发生机制的研究，还可用于临床预防及治疗的研究。

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Establishment of AOM/DSS induced a mice model of colitis associated cancer

ZHANG Yue，TIAN Jie，TIAN Xin-yu，TANG Xin-yi，YANG Jun，GENG Li-na，MA Jie，XU Hua-xi，WANG Sheng-jun
（Institute of Laboratory Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

R735.3

A

1671-7783（2015）01-0019-03

10.13312/j.issn.1671-7783.y140109

国家自然科学基金资助项目（31170849）；江苏省自然科学基金资助项目（BK2011472）

张悦（1988—），女，硕士研究生；王胜军（通讯作者），教授，博士生导师，E-mail:sjwjs@ujs.edu.cn

2014-04-18 ［编辑］刘星星