人长链非编码RNA基因SPRY4-IT1对肺癌细胞A549侵袭和迁移能力的影响

柴松 安文婷 郭丽丽 姜乐 高志嵩 李书军

长链非编码RNA（long non-coding RNA, lnc RNA）是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，在人类全基因组中有20万-40万种不同的lnc RNA。研究[1]表明lnc RNA可以通过多种方式影响编码基因的表达，在肿瘤的发生发展过程中起调控作用。SPRY4内含子转录本1（SPRY4 intronic transcript 1, SPRY4-IT1）（基因号AK024556）是转录自SPRY4基因的第二个内含子的长度为687个核苷酸的未剪接的、多聚腺苷酸化的转录产物，最初在脂肪组织中得以鉴定，且过表达SPRY4-IT1在黑色素瘤中具有促进细胞生长、迁移和侵袭的作用[2]，然而其在肺癌细胞中的作用尚未报道。本研究拟探讨SPRY4-IT1对肺癌细胞A549侵袭和迁移能力的影响，并初步探索可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料 人肺癌细胞系A549、95C、95D、Calu-3、H125、H1299、H1975、SPC-A1由河北医科大学第二医院肿瘤中心提供；抗基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）-2抗体、抗MMP-9抗体均购自武汉博士德生物有限公司；Transwell（8 μm孔径）小室及Matrigel胶购自北京乐博生物科技有限公司，实验中所用引物由广州锐博生物有限公司设计并合成，检测SPRY4-IT1在肺癌A549细胞中的表达，RT-PCR上游引物为5'-AGCCACATAAATTCAGCAGA-3'，下游引物为5'-CGATGTAGTAGGATTCCTTT-CA-3'，GAPDH上游引物为: 5'-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3'，GAPDH下游引物为: 5'-AGAGGCA-GGGATGATGTTCTG-3'。

1.2 基因全长序列克隆 根据GenBank数据库SPRY4-IT1标准序列NR-002196.1设计引物，上游引物5'-TAAGCTTGTAGAGATGGGGGTTTCATCCTGTTGG-3'，下游引物5'-ACTCGAGAAAGACTCCCTTTCCTTAAGCAGATTCAC-3’，循环条件：93oC预变性1 min，93oC变性30 s，65oC退火30 s，72oC延伸2 min，25个循环，72oC终末延伸5 min，产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物并进行产物纯化回收，将产物连接T载体后，转化DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选，挑取白色克隆，扩增后进行酶切鉴定，同时送测序分析证实扩增片段的正确性。

1.3 构建真核表达载体 双酶切pcDNA3.1载体和插入正确片段的T质粒，分别纯化回收目的片段。连接线性化pcDNA3.1载体和目的片段，转化DH5α感受态细胞，进行菌液PCR鉴定，并通过测序分析得到插入片段阳性克隆，命名为pcDNA3.1-SPRY4-IT1表达载体。用无内毒素试剂盒大量制备质粒。

1.4 细胞培养和细胞转染[3]使用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液，在37oC、含5%CO2的培养箱内培养实验中用到的肺癌细胞系。细胞生长融合度达到50%时，用Lipo 2000进行细胞转染，分为转染空载体pcDNA3.1组和转染pcDNA3.1-SPRY4-IT1表达载体组。

1.5 RT-PCR检测肺癌细胞中SPRY4-IT1的表达 培养肺癌细胞，细胞生长融合度打70%时收集细胞，通过Trizol法提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，应用上述RT-PCR引物扩增SPRY4-IT1，ABI7300检测并分析各细胞中SPRY4-IT1的水平。

1.6 细胞划痕迁移实验 将A549细胞以每孔5×105个接种于6孔板中，按照上述实验分组转染48 h后，细胞融合度达到90%以上，用无菌移液枪头部划线，置于37oC、5%CO2的细胞培养箱中培养24 h后光学显微镜下拍照，随即取5个视野，测量划痕两侧细胞间距取平均值，每组实验设3个复孔，实验重复3次。

1.7 Transwell侵袭实验 将A549细胞以每孔5×105个接种于6孔板中，细胞生长融合度为60%时按照上述实验分组转染空载体和pcDNA3.1-SPRY4-IT1过表达质粒，转染24 h后收集转染后的各组细胞，重悬于无血清RPMI-1640培养液，以每孔5×104个细胞加入预铺好Matrigel的Transwell小室上室内，下室加入500 μL完全培养液，置于37oC、5%CO2细胞培养箱中培养24 h 后多聚甲醛固定，0.05%结晶紫染色，400倍光学显微镜下计数穿膜细胞数，随即取10个视野，取平均值，每组实验设3个复孔，实验重复3次。

1.8 免疫印迹实验[4]收集细胞划痕实验后的各组细胞，用胰酶消化并收集，用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解细胞，置于冰上，每5分钟震摇细胞1次，共裂解30 min，15,000 rpm在4oC离心机上离心15 min，取上清，即为提取的细胞蛋白质。通过BCA法检测蛋白浓度，水浴变性蛋白，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，加样等量蛋白的蛋白裂解液，用10%的SDS-PAGE胶进行电泳分离，电转印到尼龙膜上，用5%脱脂牛奶的PBS缓冲液室温封闭1 h，一抗用1:1,000稀释的抗人MMP-2、MMP-9单克隆抗体4oC过夜孵育，用PBS-Tween洗膜，室温每次15 min，共3次；印迹膜用1:3,000的抗鼠IgG偶联的辣根过氧化物酶作为二抗，室温孵育1 h，用PBS-Tween洗膜，室温每次15 min，共3次。用增强型化学发光液检测试剂盒化学发光显色。检测细胞中MMP-2、MMP-9的表达，以β-actin作为内参照，结果进行灰度值分析并通过统计学检验，实验重复3次。

1.9 统计学处理 采用SPSS 13.0统计分析软件，计量资料采用均数±标准差（Mean±SD）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pcDNA3.1-SPRY4-IT1真核表达载体构建 以cDNA为模板，用引物扩增目的片段，得到与预期片段大小相符的特异性片段（图1A）。切胶纯化回收目的片段，并与pGEMTeasy载体连接，插入目的片段后，通过酶切鉴定和测序分析证实插入片段的正确性（图1B，图1C）。将目的片段SPRY4-IT1与pGEM-Teasy载体连接后的重组体经BamH I+Hind III双酶切，与相同双酶切线性化的pcDNA3.1载体连接，得到完整的pcDNA3.1-SPRY4-IT1表达载体，通过BamH I+Hind III酶切鉴定和测序分析（图1D，图1E），确认载体构建成功。将重组质粒pcDNA3.1-SPRY4-IT1和空质粒pcDNA3.1转染A549细胞后，检测细胞中SPRY4-IT1表达，结果提示转染重组质粒pcDNA3.1-SPRY4-IT1的细胞中SPRY4-IT1表达量是转染空质粒的32.7倍（图2）。

图1 pcDNA3.1-SPRY4-IT1真核表达载体构建情况。A：目的片段扩增产物；B：目的片段与T载体连接后酶切鉴定结果；C：目的片段与T载体连接后测序结果；D：目的片段与pcDNA3.1载体连接后酶切鉴定结果；E：目的片段与pcDNA3.1载体连接后测序结果。Fig 1 pcDNA3.1-SPRY4-IT1 eukaryotic expression vector construction. A: Amplification products of target fragment; B: Enzyme digestion identification results of target fragment and T vector; C: Sequencing results of target fragment and T vector; D: Enzyme digestion identification results of target fragment and pcDNA3.1 vector; E: Sequencing results of target fragment and pcDNA3.1 vector.

图2 将重组质粒pcDNA3.1-SPRY4-IT1和空质粒pcDNA3.1转染A549细胞后，检测细胞中SPRY4-IT1表达。A：目的基因溶解曲线；B：目的基因扩增曲线；C：SPRY4-IT1在细胞中表达水平比较。Fig 2 The expression of SPRY4-IT1 in pcDNA3.1-SPRY4-IT1 and pcDNA3.1 A549 cells. A：Dissolution curve of target gene; B: Amplification curve of target gene; C: The expression of SPRY4-IT1 in different cells.

图3 细胞划痕实验结果。A：培养24 h后两组细胞迁移结果的比较（×400）；B：24 h后两组细胞迁移距离比较。Fig 3 Cell scratch test results. A: Cell migration results of two groups (×400); B: Cell migration spaces of two groups.

图 4 细胞Transwell小室结果。A：显微镜下两组细胞穿过Transwell小室基底膜结果（×400）；B：两组细胞穿过基底膜细胞数目比较。Fig 4 Transwell assay results. A: Cells through the basement membrane results of two groups (×400); B: The numbers of transmembrane A549 cells of two groups.

2.2 SPRY4-IT1对细胞迁移能力的影响 将A549细胞接种于6孔板，转染pcDNA3.1-SPRY4-IT1和空载体pcDNA3.1，24 h后结果显示转染pcDNA3.1-SPRY4-IT1细胞划痕两侧细胞间距较转染pcDNA3.1细胞明显变窄（图3），提示A549细胞转染pcDNA3.1-SPRY4-IT1后细胞的迁移能力增强。

2.3 SPRY4-IT1对细胞侵袭能力的影响 A549细胞转染pcDNA3.1-SPRY4-IT1后其穿膜细胞数为（207±34）个/视野，对照组为（83±15）个/视野，组间差异有统计学意义（P＜0.05）（图4）。表明A549细胞转染pcDNA3.1-SPRY4-IT1后细胞的侵袭能力增强。

2.4 SPRY4-IT1对MMP-2和MMP-9蛋白的影响 转染pcDNA3.1-SPRY4-IT1细胞中的MMP-2及MMP-9蛋白表达较转染空质粒组均有升高（图5）。

图 5 过表达SPRY4-IT1对MMP-2和MMP-9的影响Fig 5 Effect of overexpression of SPRY4-IT1 on matrix metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9

3 讨论

在人类基因组中除了编码基因外，同时包含大量的非编码RNAs（non-coding RNAs, ncRNAs）[5]。ncRNAs虽不具备编码蛋白质功能，但能通过不同方式调控编码基因的表达和功能，lncRNA与多种类型的肿瘤发生发展有着密切联系，已成为近年来的研究热点之一[1]。这类ncRNAs既可以通过影响蛋白翻译发挥转录后调控，也可以通过影响基因的转录活性及蛋白降解等多种途径发挥功能。

SPRY4-IT1是由SPRY4基因的一个内含子转录而来，其内部含有多个二级发卡结构，已有研究表明SPRY4-IT1在黑色素瘤细胞中过表达，并且参与调控黑色素瘤细胞的凋亡与迁移[2]。有关SPRY4-IT1在肺癌中的研究尚未见报道，为了更深入地探讨SPRY4-IT1基因在肺癌细胞中的作用，本研究克隆了SPRY4-IT1基因，并构建了SPRY4-IT1真核表达载体，用脂质体介导转染A549细胞，发现原本在A549细胞中表达量很低的SPRY4-IT1，在转染pcDNA3.1-SPRY4-IT1后，表达量升高了25倍（与转染空载体相比较），能够满足进一步的实验需要。

肺癌细胞最重要的恶性行为即具有高度的侵袭转移能力[6-8]，因此我们在肺癌A549细胞中转染pcDNA3.1-SPRY4-IT1重组质粒，观察SPRY4-IT1对肺癌细胞迁移、侵袭能力的影响。我们的研究发现，转染pcDNA3.1-SPRY4-IT1细胞划痕两侧细胞间距较转染pcDNA3.1细胞明显变窄，A549细胞转染pcDNA3.1-SPRY4-IT1后其穿膜细胞数为（207±34）个/视野，对照组为（83±15）个/视野，组间差异有统计学意义（P＜0.05），可见通过细胞划痕运动实验和Transwell侵袭实验均证实过表达SPRY4-IT1后可以明显增加A549细胞的侵袭、迁移能力，提示SPRY4-IT1有可能与肺癌细胞的侵袭迁移相关。MMP-2和MMP-9是目前公认的调控肿瘤侵袭转移的关键因子[9-11]，为了进一步研究SPRY4-IT1对肺癌A549细胞侵袭迁移能力改变的作用机制，我们通过Western blot检测其中MMP-2及MMP-9的表达，发现在肺癌A549细胞中过表达SPRY4-IT1可以显著增加MMP-2和MMP-9蛋白的表达。

综上所述，在肺癌A549细胞中过表达SPRY4-IT1可增强细胞的侵袭、迁移能力；同时过表达SPRY4-IT1后MMP-2及MMP-9呈升高趋势，提示SPRY4-IT1可能通过对调控MMP影响肺癌的侵袭转移能力。可见SPRY4-IT1在肺癌的侵袭转移中发挥重要作用，为肺癌的临床治疗提供了新的药物靶点及监测指标。