复发性外阴阴道假丝酵母菌病106例菌种鉴定及药敏试验分析

刘九菊，杨文丽，张利革

（1.甘肃省平凉市华亭县妇幼保健院，甘肃平凉744100；2.甘肃省张掖市甘州区妇幼保健院，甘肃张掖734000）

外阴阴道假丝酵母菌病（vulvovaginal candidiasis，VVC）曾称外阴阴道念珠菌病，是青春期至绝经期前妇女最常见的下生殖道感染之一，多数妇女一生中至少患过一次VVC，部分经历过更多次发病。VVC 的病原体为假丝酵母菌，80%～90%是白假丝酵母菌，10%～20%为光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌等非白假丝酵母菌［1］。近些年随着国内唑类等抗真菌药物、广谱抗菌药物、激素和免疫抑制剂在临床上广泛应用和不规范使用，以及性传播疾病、糖尿病等发病率逐年升高等因素，致病假丝酵母菌发生菌种变迁或耐药，导致许多VVC患者病情反复发作，发展成复发性外阴阴道假丝酵母菌病（recurrent vulvovagina candidiasis，RVVC）。RVVC是指VVC经过治疗，临床症状和体征消失，真菌学检查阴性后又出现症状，且真菌学检查阳性或在1年内反复发作4次或4次以上［2］。RVVC的复发的因素较多，病因非常复杂，病情十分顽固，临床诊断和治疗很困难。笔者对106 例RVVC患者阴道分泌物进行假丝酵母菌培养、菌株鉴定和药敏分析，以了解病原菌的构成及药物敏感性的情况，为临床诊治和合理用药提理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年1月至2014年6月来于本院就诊的RVVC患者106例，年龄22～48岁。临床主要症状是外阴瘙痒和充血。

1.2 仪器与试剂 科玛嘉（CHROMagar）假丝酵母菌显色培养基，药敏平板：RPMI－1640 平板，抗真菌药敏纸片：氟康唑（15μg／片），克霉唑（10μg／片），咪康唑（10μg／片），制霉菌素（50μg／片），质控菌株：ATCC 90028白色假丝酵母菌，由温州市康泰生物科技有限公司提供。酵母菌鉴定卡（API 20C AUX）购于法国生物梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 嘱患者近日停用抗真菌药物，用窥阴器扩张阴道，以无菌棉拭子取阴道后穹窿分泌物2份，1份涂片镜检，1份做培养，马上保温送检。

1.3.2 涂片镜检 阴道分泌物滴加10%氢氧化钾涂片，在10×40倍显微镜下观察到圆形的芽生孢子或菌丝为假丝酵母菌阳性。

1.3.3 培养鉴定 阴道分泌物直接连续划线接种在科玛嘉假丝酵母菌显色培养基，放置28 ℃恒温箱培养24～48h后观察生长情况，培养7d不生长为阴性。依据培养基上生长的假丝酵母菌菌落颜色差异和特征来进行菌株鉴定。白色念珠菌呈翠绿色，直径大约2 mm；热带念珠菌呈铁蓝色，直径约1.5 mm；克柔氏念珠菌呈粉红色，菌落较大，模糊有微毛，直径4～5mm；光滑念珠菌呈紫色直径约2mm，其他假丝酵母菌落呈白色。其他假丝酵母菌和显色不确定的菌株经纯化后，用法国生物梅里埃API 20CCAX 鉴定卡完成。

1.3.4 药敏试验 待测菌液浓度调成0.5麦氏浊度，克柔念珠菌再稀释5倍。用无菌棉拭子沾取菌悬液，略挤压，直接均匀涂布RPMI－1640平皿（直径9cm），最后沿平皿周边绕两圈，平皿放35 ℃开盖倒扣干燥15min，待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片。每个平皿贴药敏纸4个，纸片之间距离大于24mm，与培养基边缘距离为15mm。放置于30～35 ℃恒温箱培养18～24h后测量抑菌圈直径。参照厂家说明书标准判定结果。质控菌株：ATCC90028白色假丝酵母菌。

2 结 果

106例RVVC患者分泌物涂片染色阳性为82份，阳性率为77.4%，培养阳性为96 份，阳性率为89.6%，共分离出98株假丝酵母菌，有2例同时检出2种假丝酵母菌。其中白色假丝酵母菌66株占67.4%，光滑假丝酵母菌14株占14.2%，热带念珠菌9株占9.2%，克柔假丝酵母菌4株占4.1%，其他假丝酵母菌5株占5.1%，见表1。98株假丝酵母菌抗真菌药物的药敏试验，对制霉菌素的敏感率最高（95.9%），其次是氟康唑（73.5%），克霉唑（62.3%）和咪康唑（53.0%）较低，见表2。

表1 98株假丝酵母菌分布情况（%）

表2 98株假丝酵母菌对4种抗真菌药物的药敏结果［n（%）］

3 讨 论

假丝酵母菌又称念珠菌，是人体正常菌群，多定植在口腔，肠道，生殖道和皮肤等部位。假丝酵母菌是条件致病菌，为双相真菌。约10%～20%非妊娠妇女和30%妊娠妇女阴道中有假丝酵母菌寄生，一般带菌量少，正常情况下呈酵母相不致病。只有在全身及阴道局部细胞免疫功能降低时，假丝酵母菌孢子大量繁殖，转变为侵袭力很强的菌丝相致病，引起症状。首先孢子黏附于宿主阴道上皮细胞，出芽并延长形成菌丝，菌丝穿透阴道上皮细胞侵入组织吸收营养，同时分泌多种侵袭性酶和毒素，引起阴道组织炎症反应。假丝酵母菌菌体呈圆形或卵圆形，以出芽繁殖，称芽生孢子。孢子伸长成芽管，不与母菌体脱离，形成较长的假菌丝。分泌物直接涂片在显微镜下可观察到芽生孢子和假菌丝，是VVC诊断中常用且首选的方法。分泌物真菌培养在诊断中意义较大，但由于在无症状的阴道寄居时也可出现阳性，因此培养并不常规应用，只有在出现典型阴道炎的临床症状，而显微镜检查阴性或反复发作，以及怀疑耐药菌株或非白色念珠菌感染时，采用培养方法可提高诊断的准确性［3］。

近年来随着RVVC 中非白假丝酵母菌分离率的不断上升［4］，使得RVVC的诊断和治疗更为复杂，并出现了对常用抗真菌药物耐药的现象。非白假丝酵母菌中以光滑假丝酵母菌最为常见，由于光滑假丝酵母菌只有酵母相而无菌丝相，不形成菌丝，涂片显微镜下只能看到孢子，很容易被漏诊或误诊，必须依靠培养才能确诊。光滑假丝酵母菌在碱性的环境的耐受力强于白色假丝酵母菌，常对咪唑类药物耐药，所以容易反复发作，迁延发展成RVVC。目前，直接涂片法已不能满足临床诊治的需要，需要开展分泌物假丝酵母菌的培养鉴定。传统真菌培养鉴定方法由于试验过程繁琐，回报的时间相对较长等原因在基层医院开展较少。近年来新型的科玛嘉显色培养法，因操作简单，结果快速准确，在国内外临床微生物室应用越来越广。科玛嘉假丝酵母菌显色培养基对生殖道等标本进行初代培养，阳性率高于传统的沙氏培养基（SDA），并且对混合感染区别能力更强［5－6］。笔者应用科玛嘉假丝酵母菌显色法对106例RVVC 患者行阴道分泌物培养，阳性96 份，阳性率为89.6%，共分离出98株假丝酵母菌。其中白色假丝酵母菌66株占67.4%，优势已明显下降，非白色假丝酵母菌分离率上升，达32株（32.6%），其中光滑假丝酵母菌14株占14.2%，热带念珠菌9株占9.2%，克柔假丝酵母菌4株占4.1%，其他假丝酵母菌5株占5.1%。与文献［7］报道相近。98株假丝酵母菌对4种抗真菌药物的敏感性如下，制霉菌素的敏感率最高（95.9%），其次是氟康唑（73.5%），而克霉唑（62.3%）和咪康唑（53.0%）较低，与这两种唑类药物在临床广泛使用和滥用诱导产生耐药株有关。因为许多医生在VVC 治疗时多经验性选用咪康唑和克霉唑，这两种药是非处方药（OTC），患者容易自购，长期经验用药和不规范用药可诱导假丝酵母菌产生耐药，同时筛选出对唑类药物不敏感的光滑假丝酵母菌，造成其感染率上升。

因此，临床治疗RVVC必须规范化使用抗真菌药物，常规开展真菌培养鉴定和药敏实验，选取敏感的抗真菌药物强化治疗，要求足量和足疗程，必要时联合用药［8－16］。在强化治疗达到真菌学治愈后，给予巩固治疗至半年，目前应用生态疗法在抗真菌治疗后予阴道内补充乳杆菌活菌制剂，恢复乳杆菌优势，能有效地阻抑假丝酵母菌的生长和菌丝相的形成，进一步巩固治疗效果［17］。其次，强调患者坚持在治疗结束后的定期的随访检查，建议在3个月及6个月时进行真菌培养。从而减少RVVC的发生，避免假丝酵母菌耐药性产生。

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