枸杞叶中总黄酮及芦丁提取工艺的研究

何 微，朱 捷

（宁夏回族自治区食品检测中心，宁夏 银川 750004）

枸杞具有很高的食用价值，自古以来就有“春采枸杞叶，名天精草；夏采花，名长生草；秋采子，名枸杞子；冬采根，名地骨皮”的说法。近些年来有越来越多的关于枸杞叶保健功能的研究[1-3],这些研究认为枸杞叶的药效十分广泛，具有解热、治疗糖尿病、高血压、肝肾疾病、止咳化痰、护肤等疗效。大量研究表明，枸杞叶中黄酮及芦丁含量较高[4,5], 黄酮类化合物属于植物次生代谢产物,具有多种生物活性，且具有抗氧化和降血脂作用，对预防动脉粥样硬化有较好疗效,芦丁则具有抗炎、抗病毒、消除体内自由基的作用[6,7]。因此如何高效的提取枸杞叶中总黄酮成为关注的焦点,本文主要在实验室中进行提取工艺的方法考察,对于其能在工厂中顺利的进行枸杞叶中总黄酮的提取中试实验提供科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

液相色谱仪（Agilent 1260）、紫外分光光度计（TU-1901）、分析天平（梅特勒）；芦丁对照品（中国食品药检定研究院）；枸杞叶（宁夏农林科学院提供）；乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝为分析纯；水为超纯水。

1.2 总黄酮的测定

1.2.1 对照品溶液的配制

准确称取芦丁对照品（120 ℃干燥至恒重）约20 mg，至于100 mL量瓶中，加70%的乙醇超声溶解并定容至刻度，即为约0.2 mg/mL的芦丁对照品溶液。

1.2.2 样品溶液的配制

精密称取枸杞叶粗粉1.0 g，共54份（每种处理3个平行），分别采用超声提取、回流提取、煮沸提取三种提取方式，每种提取方式中提取溶剂又分别为95%乙醇、75%乙醇、70%乙醇、60%乙醇、50%乙醇、热水6种，提取时间均为1 h。提取后，过滤，用相应溶剂洗涤滤渣并定容至100 mL的量瓶中，摇匀，待用。

1.2.3 标准曲线

吸取对照品溶液0.1、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL于10 mL溶量瓶中，加水使成2.4 mL，依次加入5%NaNO2溶液0.4 mL，混匀，静置6 min，加10%Al3NO3溶液0.4 mL，混匀，静置6 min，加4% NaOH溶液1 mL，加水至刻度, 摇匀，放置15 min，以相应试剂作空白，在509 nm波长处测定吸光度，以芦丁对照品的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标 ，得回归方程 y=0.001x-0.007 94，r= 0.999 66，表明芦丁对照品在0.002~0. 04 mg/mL 范围内线性关系良好[8]。

1.2.4 样品测定

取供试品溶液1.0 mL，按1.2.3项下操作显色，测定吸光度，以回归方程求出样品溶液中总黄酮的含量。

1.3 芦丁含量的测定

色谱条件：色谱柱为C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.1%的冰醋酸（32:68）；检测波长257 nm；流速为1.0 mL/min；进样量10 μ L。对照品溶液与样品溶液的制备同 1.2项下的方法。见表1、图1及图2。

图1 不同提取方式对枸杞叶中总黄酮含量的影响Fig.1 The influence of total flavonoids contents with different extraction methods in boxthorn leaf

图2 不同提取方式对枸杞叶中芦丁含量的影响Fig.2 The influence of rutin contents with different extraction methods in boxthorn leaf

2 实验结果

通过表1、图1及图2分析得到，3种提取方式中，采用回流提取方式提取的总黄酮和芦丁的含量最高，其中用不同浓度的乙醇作为提取液时提取效果最好。而以水为提取溶剂时，采用煮沸提取方式提取的总黄酮和芦丁的含量比采用相同溶剂的其它两种方式高。通过对比不同提取液的提取效率还可看出：75%乙醇、70%乙醇、60%乙醇的提取液中总黄酮和芦丁的含量相近﹥50%乙醇﹥95%乙醇、热水，但以 75%乙醇作为提取溶剂的提取效果最好。考虑到工厂的提取条件及有关文献的报道，推荐采用回流提取方式以75%乙醇作为提取溶剂。

表1 不同提取方法提取枸杞叶总黄酮及芦丁的考察结果(n=3)Table 1 Total flavonoids and rutin contents with different extraction methods in boxthorn leaf (n=3)

3 讨 论

3.1 空白试剂的确定

在采用分光光度法测定枸杞叶中总黄酮时，枸杞叶中叶绿素的颜色比较深，为了考察叶绿素在测定总黄酮时是否有影响，通过测定石油醚脱色后的枸杞叶与正常的枸杞叶总黄酮的含量，发现两者总黄酮的含量基本一致，说明在样品提取过程中可不用脱色处理，可用试剂空白代替自身空白。

3.2 测定波长的选择

在测定总黄酮的含量时，分别取了样品溶液和对照品溶液，按标准曲线制备的方法显色，在250～650 nm波长范围扫描，结果表明，两者均在509 nm波长处有最大吸收，所以选择509 nm为测定波长；在测定芦丁含量时，分别取供试品溶液和对照品溶液，在190~400 nm的波长范围扫描，结果表明，对照品在363 nm与257 nm的波长处有最大吸收，而供试品在329 nm波长处有最大吸收，在257 nm波长处有一肩峰。故选择257 nm为测定波长。

［1］ 张玉玺，马红军，何薇. 宁夏枸杞菜中总黄酮和芦丁含量的动态变化研究[J]. 当代化工, 2014, 43(12): 2509-2510.

［2］ 贺晓慧，贾孟辉，俞维，等. 宁夏枸杞叶基础研究述要及应用开发的前景[J]. 时珍国医国药，2007，18(5): 1111-1112.

［3］ 牛东玲，马婷婷，张自萍. 宁夏枸杞叶中总黄酮含量与抗氧化活性关系[J]. 宁夏大学学报(自然科学版)，2012, 33(1): 55-57.

［4］ 张颖，张立睦，周红英，等．不同产地枸杞子中黄酮含量的测定[J]. 中国中医药科技，2004，11(2)：102-103．

［5］ 吕海英，林丽，潘云，等. 黑果枸杞叶总黄酮抗氧化和降血脂成分测定[J]. 新疆师范大学学报(自然科学版, 2012, 31(2): 43-46.

［6］ 黄元庆，谭安民，沈泳，等. 枸杞黄酮类化合物清除氧自由基及对小鼠L1210 癌细胞能量代谢的抑制作用[J]. 卫生研究，1998，27(2)：109-111.

［7］ 李淑珍. 黑果枸杞总黄酮制备工艺优化和抗氧化、降血脂活性及成分研究[D]. 新疆: 新疆师范大学, 2009.

［8］ 张颖. 芦丁提取工艺的研究[J]. 临床合理用药, 2014, 7(4): 86-87.