miRNA-373在非小细胞型肺癌中的表达及其临床意义

刘碧翠，　杨　华，　方诗容，　梅永添，　向　薇（湖北民族学院　附属民大医院　呼吸内科，湖北　恩施　445000）

miRNA-373在非小细胞型肺癌中的表达及其临床意义

刘碧翠，杨华，方诗容，梅永添，向薇
（湖北民族学院附属民大医院呼吸内科，湖北恩施445000）

目的：探讨非小细胞型肺癌石蜡包埋组织中miR-373的表达与临床病理因素之间的关系，及其在预测非小细胞型肺癌患者预后中的作用.方法：用微阵列芯片法和qRT-PCR检测非小细胞型肺癌石蜡包埋组织和癌旁组织中的miR-373表达.采用Kaplan-Meier法分析非小细胞型肺癌患者总生存期和无病生存期.结果：在原发非小细胞型肺癌中miR-373的表达下调，并用qRT-PCR进一步验证.另外，miR-373低表达与病理组织类型、分化程度、淋巴结转移、临床分期、血管浸润、复发时间和生存时间（OS）（P＜0.05）显著性相关.Kaplan-Meier分析结果表明，miR-373低表达与高表达患者OS和无病生存期（DFS）（P＜0.05）有显著性差异，miR-373低表达患者预后较差.多因素分析显示非小细胞型肺癌中miR-373的表达水平是预测OS和DFS（P＜0.05）的独立危险因素.结论：miR-373的表达与非小细胞型肺癌患者预后显著相关，miR-373可作为预测非小细胞型肺癌患者预后的独立标志物.

非小细胞型肺癌；微阵列芯片法；实时定量PCR；miRNA-373；预后

肺癌是全世界范围内癌症死亡的首要原因.全球每年约有130万人死于肺癌［1］.肺癌按照分化程度和形态特征主要分为非小细胞型肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占85%和小细胞型肺癌约占15%.尽管各种新兴技术用于肿瘤早期诊断和新开发的化疗/靶向治疗可提高疗效，但是非小细胞肺癌患者5年生存期仍然较低（15%），复发率较高［2］.如果非小细胞肺癌在早期局限性阶段能检测到，则5年存活率可达50%，若有淋巴结转移和远处转移，而5年存活率急剧下降［3］.因此，倘若发现可用于预防、诊断和预后的分子生物标记物，在很大程度上，有利于提高非小细胞型肺癌患者的治疗效果.

微小RNA（miRNA）是一类小型的非编码的内源性调控基因表达的单链RNA.miRNA通过转录后水平调控基因表达，对细胞发育和致癌信号通路发生着重要的影响.大量的研究表明，miRNA在肿瘤中存在异常表达，并且发挥着癌基因或者抑癌基因的作用［4－7］.最近有研究表明，miRNA不仅可用于非小细胞型肺癌区分亚型，一些miRNAs基因表达分析还可以用于预测早期非小细胞型肺癌的预后和复发［8－11］.因此，非小细胞型肺癌细胞中 miRNA异常表达导致的功能异常的研究，有助于了解疾病的发病机理，也可以更好地理解miRNA在肿瘤发生和肿瘤进展中的作用.最近，已有研究表明miRNA-373与肿瘤发生和进展有关，如胃癌、乳腺癌等［12－13］.本研究探索miRNA-373在非小细胞型肺癌和癌旁组织石蜡包埋组织中的表达模式，分析miRNA-373的表达与非小细胞型肺癌的临床病理因素和预后之间的关系.

1　材料和方法

1.1病例选择

本研究通过湖北民族学院附属民大医院的伦理委员会批准和研究对象知情同意.122例非小细胞型肺癌的石蜡包埋组织标本和36例癌旁组织石蜡包埋组织标本均来自2006年1月至2008年12月期间在湖北民族学院附属民大医院胸外科行手术治疗的患者.所有患者术前均未接受放疗或化疗.所有标本经两位病理科医生确认诊断无误.患者的临床资料，如年龄、性别、临床分期、等记录整理.

1.2方法

（1）RNA的提取选用确诊为非小细胞型肺癌患者的石蜡包埋组织组织样本，Trizol法抽提总RNA，然后对RNA进行纯化，用Nanodrop 2000测定总RNA浓度.对照样本取自36例非小细胞型肺癌手术中收集的癌旁组织.RNA提取、纯化均按照试剂盒说明书操作.

（2）miRNA微阵列芯片法检测和qRT-PCR微阵列芯片法检测选取4例非小细胞型肺癌标本和4个癌旁组织标本.用Affymetrix公司的miRNA3.0仪器进行检测，依据操作说明对总RNA经过逐渐加多聚A尾、生物素标记、杂交、洗涤、染色和扫描等.然后用 Expression Console软件（1.3.1版本，Affy-metrix）分析阵列图像以获得原始数据，并使RMA标准化.Genesrping软件（12.5版本，Agilent Tech-nologies）用于后面的数据分析.探针至少含有1个所有样品都有的基团用“P”标识并被用于进一步的数据分析.miRNAs的差异表达主要通过变化倍数和P值比较来确定.基因上调和下调的统一标准是变化倍数≥2.0且P值≤0.05.聚类分析用于显示样品miRNAs表达谱之间的差别.

用qRT-PCR检测非小细胞型肺癌和癌旁组织中miRNA-373的表达.RNU6B用作内参.miRNA-373的引物为：5′-GTAGCAGGATGGCCCTAGAC-3′（正向）；5′-CGCCCTCTGAACCTTCTCTT-3′（反向）.RNU6B的引物为：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′（正向）；5′-AACGCTTCACGAATTTGC GT-3′（反向）.所有样品重复3次，候选miRNAs根据内参基因RNU6校正 miRNA-373的表达量，以公式2（－ΔΔCT）表示，其中ΔCt＝Ct目的基因－Ct参照样本，ΔΔCt＝ΔCt目的基因－ΔCt对照基因.

1.3随访和统计分析

所有受试者每3个月以电话或信件随访，随访资料同时进行更新.随访时间从手术之日起计算，末次随访时间为2014年5月31日.中位随访时间为42.8个月（5.6～62.3个月）.

所有统计分析均采用SPSS 16.0软件进行.miRNA-373的表达与临床病理特征之间的关联用Mann-Whitney检验或秩和检验.采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验分析生存活曲线.进行单因素和多因素Cox分析，用风险比（HR）及95%置信区间（CI）评价不同临床病理特征与生存期的相关性.P＜0.05表示统计有显着性差异.

2　结果

2.1非小细胞型肺癌的石蜡包埋组织中miRNAs表达谱分析和RT-PCR检测

为了探索非小细胞型肺癌和癌旁组织石蜡包埋组织中miRNA-373的表达模式，选取4例非小细胞型肺癌和4例癌旁组织的石蜡包埋组织进行miR-NAs微阵列芯片分析.在47个候选miRNAs的表达谱中，可见miRNA-373、miRNA-216a和miRNA-375在非小细胞型肺癌中表达下调（图1）.

图1　miRNAs在非小细胞型肺癌和癌旁组织中差异表谱，红色表示高表达，绿色表示低表达Fig.1　Differential expression of miRNAs in non-small cell lung cancer and paratumor tissues.Color gradation indicates the relative expression levels of miRNAs from low expression（green）to high expression（red）

为了验证对微阵列芯片法分析的miRNAs的表达变化，采用qRT-PCR方法检测了122例非小细胞型肺癌和36个癌旁组织石蜡包埋组织中miRNA-373的表达.结果显示miRNA-373在非小细胞型肺癌的相对表达量为（2.61±0.93），癌旁组织为（7.58±1.72），两组间差异有统计学意义（P＜0.001）.qRT-PCR检测的miRNA-373与微阵列芯片法分析 miRNA-373的结果相一致（P＜0.05，图2）.

图2　miRNA-373在非小细胞型肺癌和癌旁组织中Fig.2　A）miRNA-373 relative expression in non-small cell lung cancer and paratumor tissues was analyzed by qRT-PCR.B）Agarose gel electrophoresis of qRT-PCR products of miRNA-373 from paired non-small cell lung cancer tissues and paratumor tissues （NT），RNU6B was used as an internal control

2.2miRNA-373表达与非小细胞型肺癌临床病理特征的相关性

比较miRNA-373的表达情况与临床病理变量的关系时发现，miRNA-373的表达与病理组织类型（P＝0.040）、分化程度（P＝0.022）、淋巴结转移（P ＝0.008）、临床分期（P＝0.038）、血管浸润（P＝0.001）、复发时间（P＝0.018）、和生存时间（P＝0.026）之间存在显著性相关（表1）.

表1　miRNA-373表达与非小细胞型肺癌临床病理参数之间的关系Table 1　The relationship between miRNA-373 expression and non-small cell lung cancer clinico-pathological characteristics

2.3非小细胞型肺癌患者的miRNA-373的表达与DFS和OS的关系

分析非小细胞型肺癌的石蜡包埋组织中miR-NA-373的表达的预后价值，包括病理组织类型、分化程度、淋巴结转移、临床分期、血管浸润、复发时间、生存时间及miRNA-373的表达等影响因素的单因素生存分析（表2）.Log-rank检验表明，非小细胞型肺癌组织中miRNA-373高表达的患者OS较miR-NA-373低表达的患者OS更长，差异有统计学意义（P＝0.035，图3A）；非小细胞型肺癌组织中miR-NA-373高表达的患者DFS较miRNA-373低表达的患者DFS更长，差异有统计学意义（P＝0.013，图3B）.

为确定的miRNA-373的表达与非小细胞型肺癌预后的独立因素关系，对OS和DFS进行多因素回归分析（表3），miRNA-373的表达（P＝0.009）、分化程度（P＝0.012），血管浸润（P＝0.030），复发时间（P＝0.016）和生存时间（P＝0.037）与OS显著性相关.miRNA-373的表达（P＝0.003），分化程度（P＝0.011），临床分期（P＝0.018），血管浸润（P ＝0.046），复发时间（P＝0.029）和生存期（P＝0.041）均与DFS显著性相关，结果提示miRNA-373的表达是预测非小细胞型肺癌预后的独立因素.

表2　单因素Cox分析非小细胞型肺癌的总生存期和无病生存期Table 2　Univariate Cox regression analysis of OS and DFSin non-small cell lung cancer

图3　miRNA-373在非小细胞型肺癌中表达的　A）累积生存率和　B）无进展生存率曲线图Fig.3　Survival curves of 122 patients with non-small cell lung cancer.A）Overall survival；B）Disease-free survival of patients with tumors having low or high expression levels of miRNA-373.

表3　多因素Cox分析非小细胞型肺癌的总生存期和无病生存期Table 3　Multivariate Cox regression analysis of OS and DFS in non-small cell lung cancer

3　讨论

在本研究中，首先探讨了miRNA-373在非小细胞型肺癌和癌旁组织中的表达情况，用微阵列芯片法检测到miRNA-373在非小细胞型肺癌中的表达低于癌旁组织，然后用qRT-PCR法再对miRNA-373在非小细胞型肺癌和癌旁组织中表达进行验证，两种方法的结果是相一致的；其次，miRNA-373在非小细胞型肺癌中表达水平降低与病理组织类型、分化程度、淋巴结转移、临床分期、血管浸润、复发时间和生存期等具有密切的关联性，而且miRNA-373的表达水平越低肿瘤分化程度越低、临床分期越高、淋巴结转移风险越大、血管浸润可能性越大、复发时间越短和生存时间越短，结果表明miRNA-373在非小细胞型肺癌中可能有抑制肿瘤的作用，其可能的内在机制是：低表达的miRNA-373通过上调靶基因促进肿瘤的侵袭性［14－15］；低表达的miRNA-373可以通过作用靶基因提高肿瘤细胞增殖能力［16］；低表达的miRNA-373可以通过作用靶基因促进细胞的生长和加强了其生存能力［17－19］.国内有研究表明在宫颈癌中YOD1基因过表达靶向下调miRNA-373的表达而诱导宫颈癌细胞增殖，与我们的结论相一致，说明miRNA-373在肿瘤中异常表达与肿瘤细胞的生物学行为，如肿瘤细胞增殖能力等密切相关［20］.

另有研究表明，特定miRNA的表达水平异常可能与非小细胞型肺癌肿瘤的进展有关，因此检测miRNA可以预测肿瘤的预后.本研究中，非小细胞型肺癌患者 miRNA-373的表达水平越低其预后也越差，单因素和多因素Cox回归分析表明miRNA-373的表达水平低是非小细胞型肺癌患者的不良总生存期和无进展生存期密切相关的预后因素.本研究的结果显示miRNA-373可以作为非小细胞型肺癌独立预测预后的标志物.miRNA-373的表达异常可能是肺癌细胞中miRNA-373因组蛋白修饰而沉默，发挥抑癌基因的作用，并通过作用下游IRAK2 和LAMP1靶基因来负性调节间充质表型，miRNA-373低表达时提示促进肿瘤细胞生长，预示导致患者的预后较差［21］.

综上，miRNA-373在非小细胞型肺癌中的表达具有重要的临床意义，在肿瘤发展可能发挥抑癌基因的作用，可作为一个潜在的独立预测预后的因素.miRNA-373的生物学功能及其对肿瘤的抑制作用，仍有待深入研究.

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［责任编辑：朱颖?］

miRNA-373 expression in non-small cell lung cancer and its clinical significance

LIU Bicui，YANG Hua，FANG Shirong，MEI Yongtian，XIANG Wei
（Department of Respiratory Medicine，Affiliated Hospital of Hubei Institute for Nationalities，Enshi，445000，China）

Aim：To investigate the relationship between miRNA-373 expression and clinico-pathologi-cal factors in non-small cell lung cancer（NSCLC）tissue，and to evaluate the roles of miRNA-373 in predicting the prognosis of non-small cell lung cancer patients.Methods：The expression levels of miR-NA-373 were analyzed in non-small cell lung cancer and paratumor tissues by microarray and quantitative real-time RT-PCR（qRT-PCR）.Survival analysis by the Kaplan-Meier method was performed to assess the prognostic significance.Results：Downregulation of miRNA-373 was detected in most primary non-small cell lung cancer，which was confirmed by qRT-PCR analysis.Additionally，downregulation of miR-NA-373 was significantly associated with the pathological histology，differentiation，lymphatic metastasis，clinical staging，vascular infiltration，time to recurrence and the poor overall survival（OS）（P＜0.05）.Using Kaplan-Meier analysis，comparison of survival curves between low and high expressions of miRNA-373 revealed a highly significant difference between OS and disease-free survival（DFS）（P＜0.05），which suggested that low expression of miRNA-373 is associated with poor prognosis.Multivariate analy-sis showed that miRNA-373 expression was an independent risk factor for predicting OS and DFS in non-small cell lung cancer.Conclusion：These findings indicated that the expression of miRNA-373 is signifi-cantly correlated with prognosis in non-small cell lung cancer patients，suggesting that miRNA-373 may serve as an independent prognostic marker.

non-small cell lung cancer（NSCLC）；microarray；qRT-PCR；miRNA-373；prognosis

R734.2

A

1000－9965（2015）06－0477－07

10.11778/j.jdxb.2015.06.007

2015－06－30

湖北省卫生厅基金项目（JX6B1076）

刘碧翠（1978－），男，主治医师，研究方向：肺癌的基础和临床研究；Tel：0718－8301384；E-mail：liubicuihin＠126.com