盐酸小檗碱通过P13K/AKT信号通路抑制MMP2和MMP9的表达影响膀胱癌T24细胞侵袭性

高瑞林，　陈祥荣，　李毅宁，　张建育，　陈俊毅，　郭一泓，　章　峰（福建医科大学附属第二医院泌尿外科，福建　泉州　362000）

盐酸小檗碱通过P13K/AKT信号通路抑制MMP2和MMP9的表达影响膀胱癌T24细胞侵袭性

高瑞林，陈祥荣，李毅宁，张建育，陈俊毅，郭一泓，章峰
（福建医科大学附属第二医院泌尿外科，福建泉州362000）

目的：探讨盐酸小檗碱（Berberine hydrochloride）对膀胱癌T24细胞侵袭能力的影响及机制.方法：采用利用CCK8法检测膀胱癌T24细胞的生存率；transwell侵袭试验检测盐酸小檗碱对T24细胞侵袭能力的影响；West-ern-blotting分析盐酸小檗碱对P13K/AKT通路相关因子（PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT），细胞基质金属蛋白酶（MMP2、MMP9）蛋白表达的改变.结果：CCK8显示盐酸小檗碱对T24细胞的增殖抑制呈浓度和时间依赖性（P＜0.05）；与对照组比较，经盐酸小檗碱处理后膀胱癌T24细胞侵袭能力明显降低.P13K抑制剂LY294002可通过抑制P13K/AKT通路活化，抑制MMP2和MMP9的表达，相对应的盐酸小檗碱处理后膀胱癌T24细胞p-PI3K、p-AKT、MMP2、MMP9蛋白表达下降（P＜0.05）.结论：盐酸小檗碱可有效抑制膀胱癌T24细胞侵袭能力，其机制可能是通过调控P13K/AKT通路抑制MMP2和MMP9的表达.

盐酸小檗碱；膀胱癌；侵袭性；MMP2；MMP9；P13K/AKT信号通路

膀胱癌是中国常见泌尿系统恶性肿瘤之一，临床上多采用保留膀胱的经尿道电切术进行治疗.由于膀胱癌细胞高度侵袭性，保留膀胱的各种手术治疗术后常复发.故常用膀胱内药物灌注治疗以预防其复发［1］.盐酸小檗碱（Berberine hydrochloride）又名黄连素（apigenin），对多种肿瘤具有抑制作用，还可增强肿瘤细胞对化疗药物和放射治疗敏感性和耐受性，提高肿瘤治疗疗效［1－3］.但盐酸小檗碱对膀胱癌特别是瘤细胞侵袭性的抑制作用及机制目前尚清楚.本实验拟采用不同浓度的盐酸小檗碱干预膀胱癌T24细胞，检测T24细胞侵袭能力，P13K/AKT信号通路及基质金属蛋白酶（matrix melaIIopmLeinases，MMPs）家族中MMP2、MMP9蛋白的表达情况，探讨盐酸小檗碱对膀胱癌细胞侵袭的抑制作用及机制.

1　材料与方法

1.1材料

T24人移形细胞膀胱癌细胞，购自中国科学院上海细胞生物学研究所（Shanghai Institute of Cell Biology，Chinese Aeademyof Seienees）并保持于福建医科大学附属第二医院中心实验室.盐酸小檗碱购自中国药品生物制品检定所，批号：111901－201102；transwell小室购自美国BD公司.CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，MMP2、MMP9、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT抗体购自美国CST公司.P13K特异性抑制剂LY29400购自上海碧云天生物技术有限公司，批号：S1737；盐酸小檗碱应用DMSO溶解成浓度为1 mmol/L作为储存液供实验用，实验前用适量的培养液稀释到所需相应浓度.

1.2方法

（1）细胞培养和处理T24细胞培养使用的是含质量分数为10%小牛血清、质量浓度均为100 μg/mL青霉素及链霉素的RPMI-1640培养基，在体积分数为5%CO2、饱和湿度、37℃孵箱中培养，更换培养液，待细胞生长至贴满培养瓶壁时，用质量分数为0.25%胰酶消化传代.取对数生长期细胞用于实验.盐酸小檗碱实验干预：弃含体积分数为5% FBS无双抗的DMEM，各组加入配置好培养液5 mL，其中含有不同浓度的盐酸小檗碱，于37℃、体积分数为5%CO2培养箱中继续培养.P13K特异性抑制剂LY29400浓度按文献［4］取20 μmol/L用于实验干预.

（2）CCK8测定细胞增殖收集对数生长期T24膀胱癌细胞制备成密度为1.0×106的细胞悬液，接种于96孔板（100 μL/孔），置于37℃体积分数为5%CO2）培养箱培养24 h.然后加入终浓度分别为0、25、50、75、100 μmol/L盐酸小檗碱，每组细胞设5个复孔），分别培养24、48、72 h.吸除培养基，并用PBS洗涤细胞两次后加入新的培养基，然后加入10 μL CCK8溶液.置于细胞培养箱内继续孵育1 h，采用酶标仪在450 nm波长处测定OD值.加入相应量细胞培养液和CCK8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照.细胞增殖率（%）＝［A（加药）－A（空白）］/［A（加药）－A（空白）］×100.

（3）Transwell侵袭实验Transwell小室（包被matigel基质胶）检测T24细胞侵袭能力.取200 μL细胞悬液（2.0×105/mL）加入Trasnwell上室.下室小心加入600 μL含质量分数为10%血清DMEM培养液，培养箱内继续培养24 h.取出小室，弃上室内培养基，体积分数为4%多聚甲醛固定10 min，应用质量分数为1%结晶紫染色液染色约3 min，棉签轻轻擦去小室膜上表面尚未穿过的细胞.倒置显微镜下照相随机选取5个高倍镜视野，计数穿过底膜的细胞数，各组之间进行统计学分析.

（4）Western blotting检测PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、MMP2、MMP9的蛋白表达收集对数期细胞制备成密度1.0×106个/mL的细胞悬液，接种于24孔板（100 μL/孔），加入浓度分别为 0、25、50、75、100 μmol/L盐酸小檗碱共孵育48 h，再各实验组细胞加入蛋白裂解液（RIPA含PMSF）后，4℃离心收集.进行组织蛋白定量，煮沸8 min使蛋白变性，10 000/min，4℃离心5 min，取上清液，－20℃保存备用.取蛋白50 μg进行SDS聚丙烯胺凝胶电泳后，电压120 V，电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约0.5 cm；然后将蛋白印迹到硝酸纤维素膜上，质量分数为5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗MMP-2（1∶200）、MMP-9（1∶400）、PI3K（1∶200）、p-PI3K（1∶200）、AKT （1∶200）、p-AKT（1∶200），4℃孵育过夜，TBST洗膜10 min 3次；加入辣根过氧化物酶标记对应二抗室温孵育60 min，用 TBST洗10 min 3次；再用TBS洗膜10 min.ECL浸泡后X片曝光，分析结果.所用内参为β-actin.

1.3统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件处理，计量资料（均数±标准差）表示，多个样本的组间比较采用ONE-WAY ANOVA，P＜0.05为有统计学差异.

2　结果

2.1盐酸小檗碱对T24细胞增殖的抑制作用

通过CCK-8检测不同浓度0、25、50、75、100 μmol/L盐酸小檗碱、不同时间0～72 h对T24细胞增殖抑制作用，结果显示盐酸小檗碱对T24细胞的增殖抑制呈浓度和时间依赖性.与对照组相比，浓度50μmol/L以上盐酸小檗碱可明显抑制T24细胞增殖（P＜0.05）；盐酸小檗碱浓度低于25 μmol/L时对细胞抑制作用不明显，与对照组无明显差异（P＞0.05，图1）.

图1　盐酸小檗碱对T24细胞增殖的抑制作用Fig.1　Berberine hydrochloride inhibits proliferation of bladder cancer cell T24

2.2盐酸小檗碱抑制T24细胞侵袭能力

Transwell侵袭实验表明，盐酸小檗碱处理组T24细胞透过上室Matrigel胶的细胞数明显少于正常对照组（P＜0.05或0.01）.即使浓度为25 μmol/L盐酸小檗碱都能有效抑制T24细胞侵袭能力.相对于DMSO对照组细胞，在24 h时，浓度分别为25、50、75 μmol/L盐酸小檗碱抑制 T24细胞侵袭能力有效率分别达32.14%、58.92%、76.78%（表1）.

表1　盐酸小檗碱对膀胱癌　T24细胞侵袭性的影响Table 1　Berberine hydrochloride inhibits T24 cells invasion

2.3盐酸小檗碱对膀胱癌T24细胞MMP2、MMP9、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达的影响

Western blotting检测显示，与对照组相比，盐酸小檗碱作用24h后对T24细胞p-PI3K、p-AKT、MMP2、MMP9蛋白表达有明显抑制作用（P＜0.05），特别是在浓度50μmol/L下抑制作用更为明显（P＜0.01），但对PI3K、AKT表达影响小（P＞0.05，图2、表2）.LY294002（P13K抑制剂）可通过抑制P13K/AKT通路抑制MMP2和MMP9的表达，提示盐酸小檗碱或许是通过抑制P13K/AKT通路活化，减少MMP2和MMP9的表达，影响T24细胞侵袭性.

图2　Western blotting检测　MMP2、MMP9、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达Fig.2　Expression of MMP2、MMP9、PI3K、p-PI3K、AKT and p-AKT in T24 cells after treatment with Berberine hydro-chloride

表2　Western blotting检测MMP2、MMP9、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达Table 2　Expression of MMP2、MMP9、PI3K、p-PI3K、AKT and p-AKT in T24 cells after treatment with Berberine hydro-chloride　（%）

3　讨论

盐酸小檗碱是一种生物碱，主要存在于小檗属与黄连属植物中.具有抗菌、止泻、消炎等效果，临床长期用于清热解毒，抗肠道细菌感染［5］.对结肠癌［6］、乳腺癌［7］、前列腺癌［8］、肝癌［9］和肺腺癌［10］等肿瘤具有抑制作用.本研究结果也显示一定浓度的盐酸小檗碱可明显抑制膀胱癌T24细胞增殖，且抑制呈浓度和时间依赖性.

膀胱癌细胞高侵袭性是膀胱癌患者术后高复发、高致死率的重要原因，肿瘤侵袭性也是膀胱癌发生、发展进程中重要的生物学标志.有效抑制肿瘤细胞侵袭性，对于控制膀胱癌发生和发展进程具有重要意义［1，11］.在本研究中，利用Transwell侵袭实验表明盐酸小檗碱能有效抑制T24细胞侵袭能力，与Yan［1］等试验结果一致，为盐酸小檗碱临床应用于膀胱癌防治提供了实验依据.

基质金属蛋白酶（MMPs）是金属离子Zn依赖的蛋白水解酶超家族，其主要功能为降解多种细胞外基质（Extracellularmatrix，ECM）成分，而ECM中基底膜的降解是肿瘤侵袭的关键.MMP2和MMP9 是MMPs家族中重要的两个因子，能够特异性地降解ECM基底膜中的V、Vll、X型胶原、明胶和弹性纤维（构成基底膜的主要成分），与肿瘤的侵袭和转移能力密切有关［12－13］.本实验采用Western blotting方法显示盐酸小檗碱处理后，膀胱癌T24细胞MMP2、MMP9蛋白表达减少，相对应的肿瘤细胞侵袭能力也明显下降.

磷脂酰肌醇3激酶（Phosphoinositide3-kinase，P13K）是胞内具有催化活性的信号蛋白，可磷酸化胞内3，4二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）使其转化为3，4，5三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），通过激活丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT）参与调控细胞周期进程、细胞存活、细胞浸润和转移［14］.研究表明MMPs的表达呈P13K依赖的特点，活化的P13K通路（磷酸化）能使MMP2和MTl-MMP（MMPl4）的活性和表达水平上调［15－16］.p-PI3K、p-AKT是PI3K、AKT活化状态，是PI3K信号通路活化的标志.本实验证实P13K抑制剂LY294002降低PI3K、AKT磷酸化水平抑制PI3K通路激活，进而使MMP2、MMP9的表达水平则下调.Western blotting进一步显示盐酸小檗碱处理后，膀胱癌T24细胞p-PI3K、p-AKT、MMP2、MMP9蛋白表达均明显下降，提示盐酸小檗碱有可能通过下调P13K/AKT信号通路抑制MMP2、MMP9的表达，减少细胞外基质的降解，从而抑制T24细胞侵袭性.

综上，本研究证实盐酸小檗碱能有效抑制膀胱癌T24细胞侵袭能力，其机制可能与盐酸小檗碱通过下调P13K/AKT信号通路，抑制MMP2和MMP9的表达，进而影响膀胱癌T24细胞侵袭性，为盐酸小檗碱在膀胱癌临床治疗中的应用提供的实验依据.

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［责任编辑：朱颖?］

Berberine hydrochloride inhibits bladder cancer cell T24 invasion through inhibiting the expression of MMP2 and MMP9 via P13K/AKT signaling pathway

GAO Ruilin，CHEN Xiangrong，LI Yining，ZHANG Jianyu，CHEN Junyi，GUO Yihong，ZHANG Feng
（Department of Urology，the Second Affiliated Hospital，Medical University of Fujian，Quanzhou，362000，China）

Aim：To investigate whether Berberine hydrochloride can inhibit the invasion of bladder cancer cell line T24 and the underlying mechanisms.Methods：T24 cells were cultured with different concentrations of Berberine hydrochloride，and CCK8 assay was used to evaluate the cell inhibition rates.Cell invasion capabilities were evaluated by means of transwell matrix penetration assays.Activities and expressions of P13K/AKT signaling pathway-related factors（PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT）and invasion-related proteins matrix-metallopeptidase 2（MMP-2）and MMP-9，were analyzed by Western blotting.Re-sults：Berberine hydrochloride caused concentration-and time-dependent inhibition of proliferation of T24 cells.T24 cells treated with Berberine hydrochloride showed significantly decreased invasion capabil-ities（P＜0.05）.Western blotting demonstrated that P13K inhibitors（LY294002）can inhibit the ex-pression of MMP2 and MMP9.Moreover，expressions of p-PI3K，p-AKT，MMP2 and MMP9 were sup-pressed by Berberine hydrochloride in T24 cells（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Berberine hydro-chloride may play a role to inhibit bladder cancer cell line T24 invasion through suppressing the expres-sions of MMP2 and MMP9 via P13K/AKT signaling pathway.

Berberine hydrochloride；Bladder cancer；Invasion；MMP-2；MMP-9；P13K/AKT signaling pathway

R737.14

A

1000－9965（2015）06－0472－05

10.11778/j.jdxb.2015.06.006

2014－10－09

福建省卫生厅青年课题项目（2013－2－49）；泉州市科技计划项目（Z20150035）

高瑞林（1975－），男，硕士，研究方向：膀胱癌基础和临床研究

李毅宁，主任医师，Mobile：13808549738；E-mail：13808549738＠qq.com