腺病毒介导的DPP6过表达载体的构建及其在大鼠心肌细胞内表达的鉴定

王　娜，　华　乐，　杨　甫，　王　珏，　王志华，王　琼，　董　梅，　王　川（.河北医科大学　药理学教研室，河北　石家庄　05007；.河北医科大学　临床医学系，河北石家庄　05007；.河北科技大学校医院，河北　石家庄　05008）

腺病毒介导的DPP6过表达载体的构建及其在大鼠心肌细胞内表达的鉴定

王娜1，华乐2，杨甫2，王珏2，王志华1，王琼1，董梅3，王川1
（1.河北医科大学药理学教研室，河北石家庄050017；2.河北医科大学临床医学系，河北石家庄050017；3.河北科技大学校医院，河北石家庄050018）

目的：构建腺病毒介导的DPP6过表达载体并验证其在大鼠心肌细胞内的表达.方法：应用PCR技术扩增目的基因DPP6，经酶切、连接等反应将目的基因插入穿梭载体pShuttle-CMV中，进而转化至含有AdEasy质粒的大肠杆菌中，进行重组；所产生的腺病毒载体转染在HEK-293细胞中，进行腺病毒的包装、分泌和扩增，所得病毒感染大鼠心肌细胞，进行荧光及实时定量PCR（qPCR）鉴定.结果：DPP6过表达腺病毒载体构建成功，经HEK293细胞包装、扩增后，所得病毒可成功感染初生大鼠心肌细胞，观测到腺病毒携带的绿色荧光蛋白表达，qPCR检测DPP6 mRNA表达明显升高.结论：成功构建了腺病毒介导的DPP6过表达载体，并在大鼠心肌细胞内成功表达，为进一步研究DPP6在心肌细胞内的功能奠定了基础.

DPP6基因；腺病毒载体；实时定量PCR；绿色荧光蛋白；心肌细胞

二肽基肽酶样蛋白（Dipeptidy peptidase-like protein，DPP）亚型6（DPP6）是一类单次跨膜蛋白［1－5］，最近的研究提示1种家族特发性室颤的发生与DPP6的表达异常密切相关，但其致病机制尚不明确［5－6］.最近研究人员发现DPP6可与构成A-type钾通道的核心亚基Kv4相耦联，并调节Kv4的细胞内转运，并推测DPP6基因的过表达可能导致钾通道功能异常，进而导致心律失常发生［7］.在原代培养的心肌细胞中，研究某基因功能常用手段是通过腺病毒包裹某目的基因导入心肌细胞的方法，实现过表达此基因的效果.本实验拟通过构建小鼠DPP6基因过表达重组腺病毒载体，使其在小鼠心肌细胞内表达，为进一步研究DPP6基因过表达导致室颤的机制奠定实验基础.

1　材料与方法

1.1材料

（1）质粒和菌种AdEasy腺病毒表达系统和穿梭载体pShuttle-CMV（clontech公司）；DPP6-pFLC1质粒（含人DPP6基因）；大肠杆菌感受态细胞DH5α（Takala，日本）；HEK293细胞（中科院细胞库）.

（2）试剂酶：DNA重组所需的各种限制性内切酶及PCR反应体系的Taq酶（Takala，日本）.质粒DNA提取试剂盒（TIANGEN公司）；DNA胶回收试剂盒（Promega公司）；腺病毒纯化试剂盒（Pro-mega公司）.PCR引物由上海生工合成.

1.2方法

（1）DPP6基因的获取用PCR方法扩增目的基因DPP6（GenBank NM＿130797.3）.根据载体及质粒多克隆位点要求，引物设计时分别在5′端引入酶切位点EcoRV、在3′端引入酶切位点Xho I.引物设计如下：DPP6 F 5′-CCCTCGAGATGAAGGAAAAG-GCCATG-3′，DPP6 R 5′-CTGCTCCTCCTCCTGATTC-TATAGGG-3′.PCR反应体系50 μL，包含：DPP6 F 1 μL，DPP6 R 1 μL，DPP6-pFLC1 1 μL，Taq 0.5 μL，5 ×buffer 10 μL，dNTP 4 μL，ddH2O 32.5 μL.反应程序：95℃预变性5 min，95℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，30次循环，72℃10 min结束.PCR产物测序鉴定，经胶回收纯化后得到DPP6片段，保存备用.

（2）含有Dpp6基因的穿梭质粒的构建pShut-tle-CMV载体、Dpp6片段分别经EcoRV和Xhol双酶切，酶切产物用T4 DNA ligase，16℃连接过夜.将连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于卡那抗性LB琼脂糖平板，37℃过夜培养，挑单克隆摇菌提质粒.全部质粒分别用PCR和双酶切初步鉴定，将鉴定后的阳性克隆送样测序，成功得到克隆pShuttle-CMV-Dpp6.

（3）含Dpp6基因重组腺病毒质粒的制备将pShuttle-CMV-Dpp6用Pme1线性化，然后用化学转化法将其转入pAdEasy-BJ5183感受态细胞，使其在细胞内发生同源重组后，涂布于卡那抗性的LB琼脂糖平板，37℃过夜培养，得到多个阳性克隆，挑单克隆摇菌提质粒.质粒全部经Pac I单酶切鉴定，成功获得pShuttle-Dpp6-AdEasy质粒.

（4）重组Dpp6基因腺病毒的包装和扩增按照LipofectamineTM2000说明书，转染Pac I线性化的pShuttle-Dpp6-AdEasy质粒DNA至70%～80%融合的HEK293细胞中.24～48 h后观察细胞绿色荧光表达情况.10～15 d后可见所有细胞均呈悬浮状态，此时收集细胞，用PBS重悬.－70℃和37℃反复冻融3次，释放病毒，离心后收集上清，再感染HEK-293细胞，大量扩增腺病毒.

（5）腺病毒体外感染大鼠心肌细胞及荧光显微镜鉴定新生大鼠心肌组织经0.25%胰酶消化后接种在多聚赖氨酸预处理的玻片上，1d后当细胞完全贴壁并融合至80%～90%时，加入不同稀释度的腺病毒感染细胞，继续培养48 h后进行细胞固定及荧光显微镜照相鉴定.

2　结果

2.1DPP6基因的克隆

首先从DPP6-pFLC1质粒中克隆出含有特定酶切位点（EcoRV和 Xho1）的 DPP6基因片段.如图1所示，用PCR方法从DPP6-pFLC1质粒中克隆出含有特定酶切位点的DPP6基因片段，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后可见一大小约为2 400 bp的条带，与目的基因DPP6大小一致.PCR产物测序后与GenBank数据库中DPP6（NM＿130797.3）比对，一致性为100%，证明DPP6基因片段扩增正确.

图1　DPP6基因的克隆1%琼脂糖凝胶电泳结果图Fig.1　Amplification of DPP gene

2.2pShuttle-CMV-Dpp6载体的构建

将测序正确的DPP6片段与载体pShuttle-CMV连接，得到pShuttle-CMV-Dpp6质粒.为进一步验证连接产物的正确性，通过双酶切（Xho I和EcoR V）反应来鉴定以上连接产物，结果如图2所示：pShut-tle-CMV-Dpp6质粒经Xho I和EcoR V双酶切后得到2 400 bp和约7 500 bp大小的两条条带，与预期产物大小相符（图2）.

图2　双酶切鉴定　pShuttle-CMV-Dpp6载体的电泳结果Fig.2　Double digestion of pShuttle-CMV-Dpp6

2.3DPP6过表达腺病毒载体（pShuttle-Dpp6-AdEasy）的构建

线性化的pShuttle-CMV-Dpp6转入 pAdEasy-BJ5183感受态细胞中发生同源重组，在卡那抗性的LB琼脂糖平板上长出多个阳性克隆（图3A、3B）.单克隆提质粒后经Pac I单酶切鉴定，出现3.0 kb 或4.5 kb片段的质粒即为正确重组质粒pShuttle-Dpp6-AdEasy（图3C）.

图3　挑选并鉴定　DPP6过表达腺病毒载体（pShuttle-Dpp6-AdEasy）Fig.3　Pick and screen DPP6 overexpression adenovirus plasmid

2.4DPP6过表达腺病毒在HEK293细胞中的包装、分泌、扩增及其mRNA表达水平的鉴定

将pShuttle-Dpp6-AdEasy质粒用Pac I单酶切线性化，并将其用Lipofectamine转染至HEK-293细胞中，持续培养10～15 d，可观测到所有细胞均呈悬浮状态，满视野细胞均可见绿色荧光蛋白的表达.（图4）.用此制备的DPP6过表达腺病毒感染HEK293细胞后，经qPCR检测发现，与对照腺病毒（仅含GFP）相比，DPP6 mRNA表达明显升高（图5）.

图4　DPP6过表达腺病毒在HEK293细胞中的包装、分泌和扩增Fig.4　Packing and amplifying DPP6 adenovirus in HEK293cells

图5　DPP6过表达腺病毒在　HEK293细胞中内　mRNA表达的鉴定Fig.5　mRNA expression of DPP6 in HEK293 cells overexpres-sion either adenovirus（GFP）or DPP6-adenovirus

2.5DPP6过表达腺病毒在初生大鼠心肌细胞内表达的鉴定

用所获得的DPP6过表达腺病毒感染培养的初生大鼠心肌细胞，可观测到腺病毒携带的绿色荧光蛋白在心肌细胞内有明显表达（图6）.

图6　DPP6过表达腺病毒在初生大鼠心肌细胞内表达的荧光鉴定Fig.6　Fluorescence measurement of GFP in neonatal rat cardiomyocytes infected with DPP6 adenovirus

3　讨论

本研究利用AdEasy腺病毒载体系统成功构建了腺病毒介导的DPP6过表达载体，并在初生大鼠心肌细胞内成功表达，为进一步研究DPP6在心肌细胞内的功能奠定了基础.

腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因表达载体，已有广泛应用，已经发现40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒［8－11］，其具有以下优点：①宿主广泛；②目的基因表达效率高；③外源基因容量大；④无插入致突变性.但缺点是制备手段繁杂，效果不稳定.2007年，Luo等［12］将重组腺病毒技术进行改进，建立新一代AdEasy腺病毒载体系统，使其成为目前病毒干扰技术中应用最广泛的一种病毒载体系统.和传统的重组腺病毒载体系统相比，该系统采用细菌内同源重组，重组效率高.方法简单快速，大大减少了病毒的制备时间.本实验构建的携带人Dpp6基因编码区序列的重组腺病毒质粒.酶切及测序分析显示带有的Dpp6基因与GenBank中已公布序列吻合，保证了其正常的生理功能.在同源重组过程中，其穿梭载体Pshuttle-CMV携带GFP报告基因，可重组整合至腺病毒骨架质粒pAdEasy中表达，并且由双启动子各自启动GFP和目的基因的表达.因而既可通过GFP对病毒的重组过程进行追踪，对病毒转染效率进行观察；又避免了其他腺病毒体系要么无法示踪，要么为了示踪而制备报告基因和目的基因的融合基因而带来的种种问题.得到的人Dpp6重组腺病毒不仅可以有效感染其宿主包装细胞系293细胞，而且对于心肌细胞等原代细胞的感染效率也很好，本实验利用此技术，成功构建了DPP6腺病毒过表达载体，并通过绿色荧光蛋白表达验证及mRNA检测证明了此腺病毒对心肌细胞的有效感染性，这为进一步研究DPP6的在心肌细胞内的功能打下坚实基础.

DPP6，二肽基肽酶样蛋白（Dipeptidyl peptidase-like protein，DPP）亚型6，DPP6在蛋白结构上与DP-PIV具有一定的相似性，又称为DPPIV样（DPPIV-like，DPPL）蛋白，归属于单次跨膜的丝氨酸蛋白酶（serine protease）的亚家族［13］.从结构上看，DPP6具有一次跨膜结构，不具有任何蛋白酶活性.最近的研究发现一种家族特发性室颤的发生与DPP6的异常表达升高密切相关，但其详细的致病机制目前仍不清楚［6］.虽然Dpp6是一种公认的Kv4通道调节亚基，而且Kv4通道与心肌动作电位的形成密切相关，但DPP6在心肌细胞内的研究很少有报道［7］.本实验通过构建DPP6腺病毒过表达载体，从而为在心肌细胞内表达DPP6提供有效手段，从而为揭示DPP6在心脏中的作用奠定实验基础.

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［责任编辑：刘蔚绥］

Construction of adenovirus mediated DPP6 overexpression vector and its identification in rat cardiomyocytes

WANG Na1，HUA Yüe2，YANG Fu2，WANG Jüe2，WANG Zhihua1，
WANG Qiong1，DONG Mei3，WANG Chuan1
（1.Department of Pharmacology，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China；2.Department of Clinic Medicine，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China；
3.The Affiliated Hospital of Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China）

Aim：To construct adenovirus mediated DPP6 overexpression vector and to evaluate its expression in rat cardiomyocytes.Methods：DPP6 gene was amplified by PCR technique and inserted into pShuttle-CMV vector by enzyme digestion and ligation.DPP6-pShuttle-CMV constructor was transformed into E.coli BJ5183 strain containing AdEasy vector for recombination.The produced adenovirus constructor was transfected into HEK-293 cells to package，secret and amplify adenovirus，which was further infected cultured rat cardiomyocytes and identified by fluorescence and real-time PCR.Results：We successfully get DPP6 overexpression adenovirus constructor.The produced virus was identified in neonatalrat cardiomyocytes.GFP was observed in infected cardiomyocytes.DPP6 mRNA expression was markedly increased in DPP6 virus infected cells.Conclusion：Adenovirus mediated DPP6 overexpression vector was successfully constructed and its expression was evaluated in rat cardiomyocytes，which will facilitate further functional studies of DPP6 in cardiomyocytes.

DPP6 gene；adenovirus vector；real-time PCR；GFP；cardiomyocytes

R33；R34；R54

A

1000－9965（2015）06－0453－05

10.11778/j.jdxb.2015.06.003

2015－09－10

国家自然科学基金项目（31171097）；河北省自然科学基金项目（C2014206419）；教育部留学回国人员科研启动基金项目（2013－693）；河北省高等学校科学技术研究项目重点项目（ZD2015007）和自筹项目（Z2015005）.

王娜（1980－），女，硕士，讲师，研究方向：心血管药理学

王川（1971－），男，博士，教授，博士生导师，Tel：0311－86261031，E-mail：wangchuan＠hebmu.edu.cn