MDMA(3，4亚甲基二氧甲基苯丙胺)对小鼠睾丸细胞微核率及染色体畸变率的影响

赵忠桂， 刘 霜， 刘艳华， 李雅欣， 伍爱荣，周业成

(湖南环境生物职业技术学院 医药学院，湖南 衡阳421001)

MDMA(3，4-methylenedioxy-methamphetamine)，又名3，4 亚甲基二氧甲基苯丙胺，属于苯丙胺类兴奋剂，化学式:C11H15NO2. 小鼠经口灌胃LD50为27.35mg/kg.bw.MDMA 是一种化学合成毒品"摇头丸"的主要成分，具有中枢神经兴奋和致幻作用.该药物能使大脑快速释放出大量的血清素，让使用者感到精力充沛、兴奋无比和身心愉悦. 国内外大量文献资料表明［1-4］:MDMA 可引起幻觉、幻视、眩晕、空间定向力障碍，最初感受有头晕，口干，出汗等;引起中毒剂量时可有高热，大汗，心率增快，呼吸加快，血压升高，亢奋，肌肉紧张，视物模糊，甚至惊厥发作，还有学习和记忆的缺损. 严重时可致脑水肿，中毒性肝炎，高热，低钠血症，DIC，急性肾衰，猝死.患者服用后自我约束力下降，甚至出现暴力倾向，具有很大的社会危害性. 实验动物方面，有关研究表明［5-8］:MDMA 对大鼠及小鼠神经及情绪均有一定的影响作用.毒品滥用与自然生态环境也有着密切关系，如:首先毒品种植过程中容易导致树木毁坏、土壤流失，使用的杀虫剂、化肥等影响生态，其次毒品加工过程中使用的化学物质残留可造成河水污染，不仅影响水生生态环境，而且危害着居民的身体健康，因此研究新型毒品MDMA 的遗传毒性具有一定理论及实际意义.但有关MDMA 对动物及人类生殖系统遗传物质的损伤研究国内外少见报道.前期本课题组已做过相关研究，结果表明MDMA 在实验剂量内对小鼠睾丸组织细胞DNA 有一定损伤作用［9］.该研究进一步探讨MDMA 对雄性小鼠睾丸细胞微核率及染色体畸变率的影响，进一步探究其对雄性小鼠生殖细胞的遗传毒性.

1 材 料

1.1 清洁级昆明种小鼠

南华大学实验动物中心提供(合格证号:967)

1.2 受试物

MDMA (样本粒重0.25 g，纯度为55%)，由衡阳市公安局禁毒中心提供

1.3 动物处理

选用雄性小鼠80 只，7 ～9周龄，体重18 ～20 g，随机分为4 组，每组20 只.设计MDMA 三个剂量组及一个阴性对照组，常规喂养一周后开始染毒. MDMA 三个剂量组剂量分别为:低剂量组5.0 mg/kg、中 剂 量 组10. 0 mg/kg、高 剂 量 组20.0 mg/kg，阴性对照组采用生理盐水，灌胃染毒20 d，每日1 次. 饲养条件:室温约24 ℃，湿度约60%，标准饲料饲养，自由饮水.

2 方 法

2.1 微核试验

于染毒20 d 后，颈椎脱臼法处死小鼠，取出睾丸，制备睾丸细胞单细胞悬液. 采用常规微核实验法.操作步骤:制片→甲醇固定15 min →取出晾干→10%新鲜配制的Giemsa 染色10 ～15 min →冲洗染液→晾干→双盲法阅片.先用低倍镜下选择好分布均匀，染色较好的区域，再在油镜下观察计数，PCE 细胞呈灰蓝色，细胞中含有的微核多数呈圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色.一个细胞内可出现一个或多个微核. 每组观察10 000个睾丸组织细胞，记录出现的微核细胞数，并计算其微核率(‰).

2.2 染色体畸变试验

每组随机取雄性小鼠各10 只，在取样前4 小时腹腔注射秋水仙素(4.0 mg/kg·bw). 脱颈椎处死动物后，取出睾丸，制备睾丸细胞单细胞悬液备用.再按照以下操作步骤进行:离心(1 000 ～1 500 r/min，10 min)→0.075 mol/L KCl(4 mL)低渗处理→甲醇-冰乙酸固定液(2∶1)4 mL 固定2 次→制作标本片→染色(10%吉姆萨)→镜检(油镜双盲法)，每个试验组观察至少300个中期分裂相好的细胞染色体，并记录所出现的染色体畸变细胞数，并计算畸变率(%).

2.3 统计学处理

微核试验与染色体畸变试验结果均采用SPSS13.0 软件系统处理. 采用χ2检验，显著性水准为a=0.05.

3 结 果

3.1 微核试验结果

图1 正常细胞无微核出现，图2 细胞中出现单个微核.从表1 可以看出:总体微核率进行χ2检验=299.84 P ＜0.01)，差异有显著性;各剂量组分别与阴性组比较，其中高剂量组与阴性对照组差异有显著性=0.139，P ＞0.5;=20.377，P ＞0.25;.146，P ＜0.01).各剂量组之间微核率的比较，其中高剂量组与低剂量比较之间，差异具有显著性(=17. 383，P ＞0. 5;=38. 243，P ＜0.01=4.588 3，P ＞0.5). 因此该结果表明:MDMA 高剂量能诱导小鼠睾丸组织细胞微核率增加.

图1 正常细胞(放大倍数:400 ×)Fig.1 Normal cells(Magnification:400 ×)

图2 微核细胞(放大倍数:400 ×)Fig.2 Micronucleus cells(Magnification:400 ×)

表1 小鼠睾丸组织细胞微核情况Tab. 1 Testis cell micronucleus of the rats

3.2 染色体畸变试验结果

图3 为染色体断裂，图4 中可见环状染色体.从表2 中可看出:四组试验结果中总体染色体畸变率经χ2检验，总体差异有显著性(P ＜0. 01). 其中MDMA 高剂量组的染色体畸变率为4.39%，中剂量组的染色体畸变率为2. 34%，且与阴性对照组比较，差异有显著性(P ＜0.05)，低剂量组畸变率与阴性组比较，差异无显著性(P ＞0.05).. 染色体畸变率随剂量的增加而增加，存在着剂量-效应关系(r =0.850 0).，该试验结果显示MDMA 在本次研究剂量内能诱导小鼠睾丸细胞染色体畸变率增加.

图3 染色体断裂(放大倍数:1000 ×)Fig.3 Chromosome breakage (Magnification:1000 ×)

图4 环状染色体(放大倍数:1000 ×)Fig.4 Ring chromosome(Magnification:400 ×)

表2 小鼠睾丸细胞染色体畸变率情况Tab.2 Chromosome aberrations of rats’Testicular cells

4 讨 论

微核试验与染色体畸变试验均为遗传毒性的常用方法.微核实验是检测化学物质染色体损伤的基本方法，微核是染色体畸变在间期细胞中的一种特殊表现，这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的微核.微核往往是各种理化因子对分裂细胞作用而产生的，微核测试用于辐射损伤、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面. 如果与对照组比较，处理组PCE 微核率有统计学意义的增加，并有剂量-反应关系，则可认为该受试物是哺乳动物体细胞的致突变物.微核试验在遗传毒性和职业暴露人群遗传损害监测和现场生态环境检测方面，在诊断和预防肝癌、食管癌、肺癌等恶性肿瘤方面得到了大量的应用.是直观有效可行的方法，在遗传毒理、医学、食品、药物、环境等诸多方面得到了广泛的应用，该试验现在广泛应用于环境监测、辐射损伤、药物筛选及血液学研究［8］.染色体畸变试验是检测化学物质影响染色体数量和结构的基本方法，染色体畸变的原理是间期细胞经过秋水仙素处理后，再进行低渗、固定，即可在显微镜下观察到良好的中期染色体分裂相，当有害物质作用于机体时，可引起细胞染色体的损伤.当理化物质作用于细胞周期G1期和S 期时，诱发染色体型畸变，而作用于G2期时则诱发染色体单体型畸变. 染色体结构畸变类型很多，如断裂、环状染色体、单体互换、双微小体、裂隙、粉碎化、着丝点细长化、粘着等. 微核试验与染色体畸变试验均有遗传物质损伤具有一定的相关性.

MDMA 是一种近年来滥用的精神活性物质之一，MDMA 作为一种新型毒品，很受广大不良少年亲睐，严重影响社会生态环境，如①神经系统损害:主要对视觉和语音及记忆方面呈现明显的损害，与此同时，多伴有肌张力增高、腱反射亢进、震颤等体征.②肾功能衰竭:MDMA 可引起高热，课导致弥漫性血管内凝血、肌红蛋白增加、横纹肌溶解等从而致急性肾功能衰竭. ③肝脏毒性:如脂肪变性、黄疸、肝功能损害等.④社会生态问题:摇头丸易引起性病、艾滋病，且祸及家庭，危害生命与社会治安等.⑤戒断反应:MDMA 易产生依赖，停药后会出现戒断症状，主要表现为情绪低落、抑郁、躁狂等.2014年国际禁毒日主题是远离毒品、健康生活、拥抱美好人生.毒品的泛滥不仅危害人民的身心健康，同时给经济发展和社会进步带来巨大威胁.日趋严重的毒品问题已成为全球性的灾难. 据美国国家地理网站报道，毒品生产及其相关过程对生态环境的破坏不容忽视.如摇头丸生产及制备环节带来大量的毒垃圾和难以负担的森林危害，加工过程中产生的烟雾严重影响呼吸道健康，而且会给周围区域造成巨大危害;大麻及可卡因等种植过程消耗大量电力能源，对环境破坏极大. 据联合国毒品与犯罪问题办公室估计，可卡因的生产加速哥伦比亚、秘鲁和玻利维亚的雨林被毁的进程，而海洛因耗费土地和燃料，全球市场对海洛因和其他鸦片剂的需求，加速了森林砍伐，阿富汗和东南亚的农民把森林砍伐一空，用来种植罂粟. 与古柯种植一样，罂粟很快就会耗尽森林土壤的养分，迫使种植者砍伐和烧毁新林区，海洛因生产带来的环境问题远远超过种植罂粟.提炼从罂粟里提取的乳状汁液，把它制成海洛因，需要使用石灰、氨水、丙酮和盐酸等有毒物质.这一过程通常是在密林中进行的，这些有毒物质最终会被丢弃，或者渗入排水渠，造成间接水污染. 资料显示［10］我国的禁毒形势非常严峻，境外毒品渗透加剧、境内制贩毒活动猖獗、制毒原料走私流失突出、吸毒群体不断扩大. 要根除毒品危害，必须深化国际合作，从源头上遏制毒品的渗透.

5 结 论

研究得出:MDMA 高剂量能诱导小鼠睾丸组织细胞微核率增加，中剂量组及高剂量组能使小鼠睾丸细胞染色体畸变率增高，结合研究组其他研究结果提示MDMA 对雄性小鼠生殖系统遗传物质有一定的损伤效应. 研究不仅具有理论研究意义，同时可为临床上MDMA 对人类生殖健康影响提供一定的参考依据，为MDMA 引起的相关疾病预防与治疗提供新的思路，同时为MDMA 服用者提供正确的生育指导，提高生育质量，减少出生畸形.

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