制浆造纸废水曝露对藻类的毒性效应

夏枫峰，晁　敏，沈新强，王云龙

（1.舟山市水产技术推广站，浙江舟山　316000；2.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海　200090）

·研究简报·

制浆造纸废水曝露对藻类的毒性效应

夏枫峰1，晁敏2，沈新强2，王云龙2

（1.舟山市水产技术推广站，浙江舟山316000；2.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海200090）

以AOX含量为17.87 mg/L，CODCr含量为707.0 mg/L的化学制浆造纸漂白废水为实验液，开展其对三角褐指藻和扁藻的96 h毒性效应实验。结果表明：实验用造纸废水对三角褐指藻和扁藻的96 h-EC50AOX浓度介于2.91～2.87 mg/ L，CODCr浓度介于176.3～138.7 mg/L。与同等稀释条件下鱼类、虾蟹类和贝类的实验相比，藻类的敏感性较高。

毒性效应；AOX；生长抑制率

沿海地区的工业废水通常选择海洋处置方法，废水出排放扩散器后在海流作用下快速得到稀释扩散，然而含有持久性有机污染物的工业废水如造纸废水等进行海洋处置需慎重考虑其对海洋生态系统可能的风险影响，如经氯漂白的造纸废水中可能含有200多种有机氯化物，其中毒性最强的是被国际癌症研究机构（IARC）列为I类人体致癌物的2，3，7，8-TCDD（二恶英的一种），这些难以降解的污染物可以通过食物链的累积作用进而影响到人类健康［1-3］。为限定废水中有机氯化物总量，国际上通常以AOX（Absorbable organic halogens，可吸附有机卤化物）作为替代具体有机氯化物的控制指标。尽管我国《造纸工业水污染物排放标准》（GB3544-2008）中也把AOX列为强制监测项目，针对不同企业排放标准作出了不同规定，但受到漂白工艺、造纸原料、温度等多种因素的影响，产生的废水中有机氯化物的种类、含量有所不同，仅通过AOX值的大小难以反映出其毒性强弱和对生态环境的影响。

近年来，生物监测在水体污染调查研究中得到了广泛应用［4-5］。生物监测基本原理就是将生物体暴露于污染物中，通过对实验组与空白对照组进行对比分析来评价污染物毒性的一种方法［6］。由于对污染物进行单纯的理化分析难以有效评价其潜在危害，而暴露于污染水体中的生物能够在生长过程中将污染物的影响反映出来，进而对多种混合有毒物质的毒性作出直观、合理的评估［7-9］。鉴于不同生物对污染物的敏感程度不同，国内外学者开展了造纸废水对多种生物的毒性效应研究，受试生物涉及生态系统的各个层次，如细菌、贝类、虾蟹类、鱼类等［10-12］。藻类是水生生态系统的初级生产者，具有个体小、繁殖快、对毒物敏感等特点［7］。本文选择三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum和扁藻Platymonas sp.两种藻类来研究不同稀释浓度下造纸废水的毒性效应，对研究造纸废水的最大安全稀释度具有重要意义。

1　材料与方法

1.1藻类培养

三角褐指藻和扁藻的采用海水盐度为20的f/2藻类生长培养基［13］培养。取处于指数生长期的藻液10 mL，接种于150 mL经灭菌处理的三角烧瓶中，加培养液至总体积为50 mL，置于光照培养箱中扩大培养，光、暗周期比设为12:12，为使藻类在最适温度条件下生长，三角褐指藻培养温度为16℃，扁藻为28℃［14］。

1.2造纸废水对藻类毒性试验

实验用造纸废水取自某纸业公司的化学制浆造纸漂白废水，废水经初级沉淀、过50 μm醋酸纤维素滤膜，作为实验原液。

毒性试验设9个实验组，每组设2个平行样，各组试验液总量100 mL，含藻液20 mL，其余为造纸废水和过滤海水按比例配比，其中，造纸废水在各组的比例分别为80%、50%、22.2%、10%、5%、3.3%、1%、0.33%、0%，0%作为对照组。

毒性试验共进行96 h，试验开始后，分别于0、24、48、72和96 h取1 mL样品，用颗粒计数仪Multisizer 3（COULTER Counter）测试藻类数量。

实验液的CODCr采用重铬酸盐法测定，AOX采用有机卤素（AOX）分析仪MULTI X2000（德国）测定，测定原理同库仑法。

1.3数据处理

各时刻颗粒计数仪计数数据转化为藻细胞密度。以0 h的密度为基准值，将0、24、48、72和96 h数据标准化，0 h的标准化值为1。

以藻类生长抑制率作为评价造纸废水对藻类生长毒性效应的指示指标，公式如下：

其中：Em为1:n稀释比浓度某时刻的生长抑制率（可取24、48、72和96 h）；Ntn为1:n稀释比浓度某时刻的标准化值（可取24、48、72和96 h）；Ncn为对照组某时刻的标准化值（可取24、48、72和96 h）。

藻类生长受影响废水浓度（Effective Concentration，EC）计算方法为：把造纸废水稀释浓度比转化为稀释百分比C，Ln（C）与某时刻藻类生长抑制率作线性回归分析，利用SPSS软件预测得藻类不同比率条件下的EC值（如EC10、EC25、EC50、EC75等），同时可计算出EC的95%置信区间。

2　结果与分析

2.1废水主要理化指标

废水中主要污染物含量以CODCr和AOX表示，表1列出了原液及不同稀释比条件下的CODCr和AOX值，其中原液中AOX含量为17.87 mg/L，CODCr为707 mg/L，悬浮物含量为37 mg/L，略高于现行《造纸工业污染物排放标准》（GB3544-2008）对AOX规定排放最大限值（15 mg/L）。

表1　不同稀释比下实验液的CODCr和AOX含量（mg/L）Tab.1　Concentrations of CODCrand AOX in the dilution gradient solutions from pulp mill effluent

2.2造纸废水曝露条件下的藻类生长曲线

2.2.1三角褐指藻

三角褐指藻96 h生长曲线如图1所示，当废水按80%、50%、22.2%稀释时，第24小时藻细胞负增长，细胞的增殖受到造纸废水抑制，从第48小时开始，22.2%组藻细胞密度有所增加，而80%、50%两组藻细胞密度没有继续增加。在第24小时，10%～0.33%组及对照组的藻细胞密度均没有明显增长，从第48hr开始各组细胞开始增殖，对照组生长速率一直最高，10%组一直最低。

图1　三角褐指藻在不同稀释浓度实验条件下的96 h生长曲线Fig.1　Growth curves of Phaeodactylum tricornutum in the dilution gradient solutions from pulp mill effluent

图2　扁藻在不同稀释浓度实验条件下的96 h生长曲线Fig.2　Growth curves of Platymonas sp.in the dilution gradient solutions from pulp mill effluent

2.2.2扁藻

扁藻96 h生长曲线如图2所示，第24小时所有组包括对照组生长速率均很低，从第48小时开始各组细胞开始增殖，对照组生长速率一直最高，80%组一直最低。

2.2.3不同时刻藻类密度标准化值分布曲线

（1）三角褐指藻：从图3三角褐指藻密度标准化曲线直观判断，5%浓度及低浓度在24、48、72 h标准化密度基本接近，将三角褐指藻5%～0.33%浓度范围第24、48、72和96小时藻类生长速率分别与对照组生长速率作t检验，结果表明，24、48和72 h三角褐指藻生长速率与对照组无显著差异（p值分别为0.09、0.31、0.26），而96hr具有显著差异（p值为0.02）。以上结果表明低浓度废水曝露（5%～0.33%）对藻类生长的抑制主要发生在第4天。

（2）扁藻：把扁藻5%～0.33%浓度范围24、48、72和96 h生长速率分别与对照组生长速率作t检验，结果表明第24和48小时三角褐指藻生长速率与对照组无显著差异（p值分别为0.757、0.24），而72和96 h具有显著差异（p值分别为0.009和0.022）。以上结果表明低浓度废水曝露（5%～0.33%）对扁藻生长的抑制主要发生在第3天以后。

图3　三角褐指藻和扁藻24、48、72和96 h密度标准化值分布曲线Fig.3　Distribution curves of density standardization for Phaeodactylum tricornutum and Platymonas sp.in the dilution gradient solutions from pulp mill effluent in different time

2.3造纸废水曝露对藻类生长影响浓度

造纸废水稀释浓度取对数，与三角褐指藻、扁藻的96 h生长抑制率分别作线性回归分析，得线性方程为：

三角褐指藻：Ln（C）=6.111×抑制率%-6.328 1（R2=0.92）

扁藻：Ln（C）=7.932 3×抑制率%-7.118 3（R2=0.95）

经显著性检验，结果分别为F（1，7）=79.458，p=0.000 01＜＜0.000 1；F（1，7）=130.108，p=0.000 06＜＜0.000 1，表明两种受试藻类的Ln（C）与抑制率之间均存在极显著线性相关关系。

利用SPSS软件预测两种受试藻类不同生长抑制率的曝露浓度及95%置信区间（表2），其中96 h-EC50值分别为3.79%、4.28%（体积百分比），95%置信区间分别为2.20%～6.52%、2.78%～6.57%。

表2　三角褐指藻50%生长抑制率时的稀释浓度及其95%置信区间Tab.2　Dilution volume fractions for Phaeodactylum tricornutum in growth inhibitions 50%

3　讨论与结论

藻类是海洋中初级生产力提供者，造纸废水入海后对浮游植物生长抑制程度成为影响受纳海域生态系统稳定的重要因素。研究证明，藻类比鱼类、无脊椎动物对造纸废水中有机氯化物更敏感，如在波罗地海水域，废水中含有50 mg/L的氯酸盐就可使12 km2海域范围的大型褐藻消失，取而代之的是蓝绿藻和红藻，初级生产力和浮游动物区系也相应受到长久性影响［15］。KALLQVIST等［16］的研究表明，当废水中AOX含量为3.6 kg/t（16.4 mg/L）时对中肋骨条藻的EC50为2.4%～2.9%。

实验用造纸废水对三角褐指藻和扁藻的96 h-EC50稀释浓度比分别为3.79%和4.28%，其AOX含量介于2.91～2.87 mg/L，CODCr含量介于176.3～138.7 mg/L。同等稀释条件下，该造纸废水对斑马鱼Brachydanio rerio、对脊尾白虾Exopalaemon carinicauda、中华绒螯蟹Eriocheir sinensis大眼幼体和缢蛏Sinonovacula constricta 96 h-LC50（半致死浓度）稀释浓度比分别为7.14%、14.3%、44.4%和62.9%［11］。造纸废水对藻类、鱼类、虾类、蟹类、贝类的毒性效应依次降低，藻类的敏感性高于鱼类、虾蟹类和贝类，这与BAILEY等［17］研究的造纸废水对不同种类淡水水生生物敏感性结论相一致。

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Exposure Effect of Pulp Mill Effluent on the Growth of Algae

XIA Feng-feng1，CHAO Min2，SHEN Xin-qiang2，et al
（1.Fisheries Technology Extending Stations of Zhoushan City，Zhanshan316000；2.East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Shanghai200090，China）

The 96 hr algae growth inhibition tests of Phaeodactylum tricornutum and Platymonas sp.were conducted on dilution gradient solutions from pulp mill effluent，which contained 17.87 mg/L AOX，707.0 mg/L CODCr.It showed that the algal 96 h-EC50varied from 2.87 to 2.91 mg/L for AOX，and from 138.7-176.3 mg/L for CODCr.Algae exhibited the greatest sensitivity compared with fish，shrimp，crab and shellfish on the same diluted series test.

toxic effect；AOX；growth inhibition

X503.225

A

1008-830X（2015）02-0192-04

2014-12-10

国家重点基础研究发展计划（2010CB429005）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目（中国水产科学研究院东海水产研究所）（2007M02）

夏枫峰，女，浙江舟山人，研究方向：养殖生态.