大鼠脑挫伤后caspase-3和HAX-1的表达

李周儒 ，滕道辉 ，董国凯 ，殷文江 ，蔡红星

（1.徐州医学院法医学教研室，江苏 徐州 221002；2.徐州市铜山区公安局刑警大队，江苏 徐州 221100）

损伤时间是指从受伤到死亡所经历的时间，推断损伤时间是法医病理学研究的重点与难点[1]。脑损伤是法医学检案常见的死亡原因，脑损伤时间的准确推断能为案件的侦破提供重要线索。

脑损伤后神经元和神经胶质发生凋亡，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）家族是与凋亡密切相关的调节基因，而caspase-3是家族中最重要的凋亡执行者[2-3]。研究[4-5]发现，caspase-3在脑挫伤后呈现一定的时序性变化。而造血干细胞特异性相关结合蛋白-1（HCLS1-associated protein X-1，HAX-1）是一种新的细胞凋亡调节蛋白，具有强大的凋亡抑制作用[6-7]。

基于此，本实验通过建立大鼠脑挫伤模型，利用Western印迹法、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TdT-mediated dUTP nick-end la-beling，TUNEL）和激光共聚焦显微镜检测技术，检测脑挫伤后凋亡蛋白caspase-3及抗凋亡蛋白HAX-1在不同时间段表达的变化规律，从而为脑损伤时间的推断提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1 实验材料

健康SD雄性大鼠80只（徐州医学院实验动物中心提供），体质量（190±30）g。

caspase-3（sc-22139）一抗、β-actin（sc-130656）一抗、HAX-1（sc-34273）一抗（美国 Santa Cruz公司），AP标记的二抗（美国Sigma Chemical公司），驴抗兔荧光二抗（A21207，美国 Invitrogen公司），BCA 试剂盒（浙江碧云天生物试剂有限公司），TUNEL试剂盒（北京中山生物试剂公司），NBT/BCIP试剂盒（美国Promega公司）。

ZH-ZYQ型自由落体脑损伤模型打击器（淮北正华生物仪器设备有限公司），FV1000激光共聚焦显微镜（日本Olympus公司），JD801病理图像分析系统。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型的建立

Western印迹法和激光共聚焦显微镜技术各用40只大鼠，40只大鼠随机分为正常组，假手术组，颅脑损伤后 2h、6h、12h、1d、3d、7d 组，每组 5 只。

利用自由落体脑损伤模型打击器建立大鼠脑挫伤模型：大鼠用20%水合氯醛（350g/kg）腹腔麻醉后，俯卧位固定头部及四肢，除去头皮处鼠毛。用手术刀切开大鼠头部中线皮肤，切口后端以45°角向左前下延伸，形成三角形皮瓣。向头侧翻开皮瓣，剥离骨膜，充分暴露左侧露骨。以左侧颅骨眼眶凹陷为支撑点，用持针器咬开，暴露硬脑膜，并向后在左顶骨扩大成直径6mm的圆形骨窗，注意保护脑膜。将撞杆头端置于骨窗硬脑膜外，其外垂直金属套管，用40g打击棒（圆柱形，直径1.3cm，高5.3cm，打击棒头部球形直径3mm）沿外周金属管从25cm高度自由落下冲击撞针，造成大鼠左侧局部脑挫裂伤。假手术组麻醉及手术步骤与脑挫伤模型相同，但不用打击棒打击动物头部。正常组及假手术组均在相应部位进行取材作为对照。

1.2.2 蛋白样品制备及Western印迹法检测

在脑挫伤模型建立后 2 h、6 h、12 h、l d、3 d 和 7 d各取5只直接断颈处死，以挫伤灶为中心做脑冠状切面取材（大小为3 mm×3 mm×2 mm），置液氮中冻存，备用。进行组织样品的提取及caspase-3和HAX-1蛋白含量的测定，分装，置-80℃冰箱待用。

等量蛋白样品经7.5%SDS聚丙烯凝胶电泳分离后，以湿转法转移至PVDF膜上，经3%BSA封闭后加入一抗4℃过夜。用洗涤液洗膜，加入相应的二抗，37℃反应2h，洗膜。以NBT/BCIP显色，结果用图像分析系统处理，蛋白表达水平以目的蛋白与对照蛋白（β-actin）的比值来表示。

1.2.3 TUNEL染色及激光共聚焦显微镜技术检测

分别在建立大鼠脑挫伤模型后的各时间点，用20%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔麻醉大鼠，于剑突下横向沿胸壁左右向剪开暴露心脏，用平头穿刺针从心尖插入左心室，剪开右心耳，依次用生理盐水、4%多聚甲醛溶液灌注，断头取脑，置于4%多聚甲醛溶液后固定6 h，30%的蔗糖脱水至脑组织下沉，OCT包埋。切片，厚度25μm。取冰冻切片，0.4%的Triton X-100-PBS打孔15min，4℃血清封闭1h，加入 HAX-1一抗4℃过夜，0.1%Triton X-100-PBS洗涤5 min×3次，加入荧光二抗，避光室温孵育2h，甘油-PBS封片，激光共聚焦显微镜扫描图片。红色荧光为HAX-1，代表HAX-1的阳性细胞。

参照试剂盒上的说明书，提取样品组织的冰冻切片，贴片，用TUNEL反应液在湿盒内37℃避光孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗片 10 min×3次，甘油-PBS封片，激光共聚焦显微镜扫描图片。绿色荧光为TUNEL染色细胞，代表凋亡细胞。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 Western印迹法检测脑挫伤后caspase-3和HAX-1的表达

蛋白半定量结果显示：脑挫伤后caspase-3表达开始升高，与正常组及假手术组比较差异有统计学意义（P＜0.05），6 h～1 d 逐渐升高，至伤后 3 d 左右，caspase-3表达强度达峰值（P＜0.05），此后开始下降，但7d左右仍维持在较高表达水平（P＜0.05）（图1A）。HAX-1在正常组及假手术组有低表达，伤后2h在损伤部位的表达开始升高，与正常组及假手术组比较差异有统计学意义（P＜0.05），伤后 6 h，HAX-1 表达强度达峰值（P＜0.05），随后逐渐下降，但伤后 12 h～1 d，HAX-1 表达仍高于正常水平（P＜0.05），至伤后 3～7d几乎测不到（图1B）。

图1 脑挫伤后各组caspase-3和HAX-1的半定量结果

2.2 激光共聚焦显微镜下脑挫伤后HAX-1阳性细胞和TUNEL染色细胞

正常组及假手术组HAX-1阳性细胞数较少。脑损伤后2h HAX-1阳性细胞数明显增加（P＜0.05），伤后 6 h左右最多（P＜0.05），12 h后逐渐下降，伤后 3 d HAX-1阳性细胞数极少（图2A）。

正常组及假手术组TUNEL染色细胞数较少，存活细胞最多。伤后2h，凋亡细胞数明显增加（P＜0.05）；此后逐渐增多，至伤后3 d左右凋亡细胞数最多（P＜0.05），此后逐渐下降，但7 d左右与正常组比较仍维持较高水平（P＜0.05，图 2B）。

图2 脑挫伤后激光共聚焦显微镜下各组HAX-1阳性细胞及TUNEL染色细胞的表达

脑挫伤后激光共聚焦显微镜下HAX-1及TUNEL染色细胞的变化见图3～4。

图3 脑挫伤后激光共聚焦显微镜下HAX-1阳性细胞的表达 ×100

图4 脑挫伤后激光共聚焦显微镜下TUNEL染色细胞的表达 ×100

3 讨 论

脑损伤时间推断是法医病理学研究的重要课题，推断脑损伤时间能为案件的侦破提供重要线索，在缩小侦察范围等方面提供帮助。法医病理学者在检测脑内多种生物活性物质的时序性表达方面进行了大量研究[8-10]。

caspase-3是重要的凋亡执行者，能切割不同的底物，从而放大蛋白酶级联反应，最终导致细胞死亡，既参与凋亡启动，又参与凋亡程序执行，尤其在凋亡执行阶段，负责对全部或部分关键蛋白进行酶切（激活或灭活），与细胞凋亡关系密切[11-13]。caspase-3在脑及皮肤损伤等方面已有大量的研究[4，14-15]，也证实了其作为一种指标可以用来推断脑损伤时间[5]。HAX-1是能与造血系统细胞特异性蛋白1（hematopoietic lineage cell-specific protein 1，HS1）存在相互作用的蛋白，广泛表达于多种组织、细胞的线粒体内，少数分布在内质网和核膜上[16-17]，能够在脑部缺血缺氧过程中降低caspase-3的活性，抑制细胞的凋亡，HAX-1过表达的实验进一步证实了HAX-1对细胞凋亡的抑制作用[18]。上述研究主要运用了传统的免疫组织化学及图像处理技术进行分析，本实验加入激光共聚焦显微镜免疫组化检测方法，进一步增加实验结果的准确性、客观性。

本实验结果表明，caspase-3蛋白定量趋势与TUNEL染色细胞表达趋势基本平行，且损伤当时二者均开始升高，3d左右达峰值，后逐渐下降，但7d左右仍维持较高水平。因此认为，可以用TUNEL染色检测细胞凋亡及caspase-3蛋白定量来推断脑损伤经过时间。

在脑损伤动物实验[12-13]中发现，全脑缺血再灌注后皮质神经元中HAX-1在短期缺血中表达升高，可能参与神经元的抗凋亡，随着缺血时间延长，其表达水平降低，与神经元的凋亡增强相关。本实验结果显示，HAX-1在脑挫伤后2h表达开始升高，伤后6h左右达峰值，随后逐渐下降，3d后低于正常水平。因此认为，HAX-1免疫组化染色可以用于脑损伤时间的推断。

本实验表明，在脑挫伤后凋亡蛋白caspase-3和抗凋亡蛋白HAX-1的表达均具有时序性变化，可以用来推断脑损伤时间。在损伤早期，HAX-1随着细胞凋亡的出现会大量表达，达到抑制凋亡的作用，但在损伤后，凋亡是个不可逆的过程，随着时间的延长，凋亡蛋白表达越来越多，而HAX-1受到抑制，表达慢慢下降。因此，可以认为HAX-1适用于早期脑损伤时间的推断，而caspase-3适用于稍晚期脑损伤时间的推断。

Jitkaew等[19]认为HAX-1的抗凋亡作用是通过抑制caspase-3途径发挥作用的。Lee等[7]研究表明，在细胞凋亡过程中HAX-1细胞内水平受caspase-3调节。综上，我们推测在某一个时间点同时检测抗凋亡蛋白HAX-1和凋亡蛋白caspase-3两者的表达更有利于脑损伤时间的推断，且联合应用更多的指标，综合判断、分析，对于脑损伤时间推断具有更大价值，更具科学性和准确性。