多重耐药鲍曼不动杆菌耐药情况及其携带耐消毒剂基因的研究

王正兰　李临平　李　雪　段秋红杨晓文　张小玲　梁红萍　张燕军

多重耐药鲍曼不动杆菌耐药情况及其携带耐消毒剂基因的研究

王正兰1李临平1李雪1段秋红1杨晓文1张小玲1梁红萍2张燕军2

作者单位:030012太原市，山西省人民医院院感科1，检验科2

目的了解多重耐药鲍曼不动杆菌的耐药情况及携带耐消毒剂基因情况。方法收集2014年1月-2015年2月山西省两所三级甲等医院50株多重耐药鲍曼不动杆菌，采用K-B法检测抗菌药物的敏感性，采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测耐消毒剂基因qacEΔ1。结果50株多重耐药鲍曼不动杆菌主要见于神经外科、ICU、呼吸内科，分别为15株（30.0%）、10株（20.0%）、9株（18.0%）。其中痰标本34株（68.0%）、创面分泌物标本2株（4.0%）、血标本2株（4%）、尿液标本5株（10.0%）、引流物标本2株（4.0%）、神经外科患者病床栏杆表面标本5株（10.0%）。50株多重耐药鲍曼不动杆菌对氨苄西林/舒巴坦的耐药率为96.0%（48/50）、左氧氟沙星为70.0%（35/50）、头孢他啶为100.0%（50/50）、头孢哌酮/舒巴坦为100.0%（50/50）、亚胺培南为98.0%（49/50）。50株多重耐药鲍曼不动杆菌中，有21株携带耐消毒剂基因qacEΔ1，阳性率为42.0%。结论多重耐药鲍曼不动杆菌耐药情况十分严重，并且携带有耐消毒剂基因qacEΔ1。因此，应严格规范使用抗菌药物，并采取相应的措施预防多重耐药鲍曼不动杆菌在医院环境中流行爆发。

多重耐药菌；鲍曼不动杆菌；药敏试验；消毒剂；耐消毒剂基因；qacEΔ1；K-B法

鲍曼不动杆菌现已成为世界范围内医院感染的主要病原菌之一，随着耐药菌株的日益增多，鲍曼不动杆菌感染已经成为许多国家重要的公共卫生问题。消毒剂的使用对预防与控制医院感染的发生起到了重要的作用，因此，病原菌对消毒剂的敏感情况越来越受到重视［1］。近年来，国内外研究多关注于医院感染常见致病菌对消毒剂的敏感性，如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、念珠菌等，而对多重耐药鲍曼不动杆菌的耐消毒剂基因研究较少。本文对多重耐药鲍曼不动杆菌的耐药情况及携带耐消毒剂基因情况进行研究，为医疗机构实施消毒措施提供实验依据。

1　材料与方法

1.1菌株来源收集2014年1月至2015年2月山西省人民医院、山西大医院微生物室临床送检标本中培养鉴定的多重耐药鲍曼不动杆菌共50株。质控菌株为鲍曼不动杆菌ATCC 19606，购自卫生部临检中心。

1.2仪器与试剂细菌的鉴定采用VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪 （生物梅里埃中国有限公司）；药敏试验所用药敏纸片哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、头孢吡肟、左氧氟沙星、环丙沙星、头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、氨苄西林/舒巴坦、亚胺培南、妥布霉素、庆大霉素，均购自英国OXOID公司。Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司），Applied Biosystems 2720 thermal cyclerPCR仪 （美国赛默飞世尔科技股份有限公司）。

1.3方法

1.3.1菌株鉴定与药敏试验细菌鉴定采用全自动微生物分析仪鉴定到种，并用K-B法进行常规药敏试验，药敏试验结果参照2013年CLSI的标准判定。

1.3.2细菌DNA提取取1 ml过夜培养的细菌菌液，加入1.5 ml离心管中，以离心半径8.5 cm，室温8000 r/min离心1 min，弃上清，收集菌体。加入180 μl buffer Diaestion，再加入20 μl proteionase K溶液，振荡混匀，56℃水浴1 h至细胞完全裂解。加入200 μl buffer BD充分颠倒混匀，加入200 μl的无水乙醇充分颠倒混匀，将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2 min，再以离心半径8.5 cm，12 000 r/min室温离心1 min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱放回收集管中，加入500 μl PW solution，以离心半径8.5 cm，10 000 r/min离心30 s倒掉滤液，将吸附柱放回收集管，再离去残留的PW solution。取出吸附柱，放入1.5 ml的离心管中，加入50～100 μl CE buffer静置3 min，以离心半径8.5 cm，12 000 r/min室温离心2 min，收集DNA溶液。

1.3.3基因扩增采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测多重耐药鲍曼不动杆菌的耐消毒剂基因 qacEΔ1。PCR引物，F:TAGCGAGGGCTTTACTAAGC，R:ATTCAGAATGCCGAACACCG，目的产物长度300 bp。PCR体积为25 μl，其中10 buffer（with Mg）1 μl，dNTP 1 μl，Taq聚合酶0.2 μl，每反应体系F、R引物各0.5 μl，加双蒸水至25 μl。反应条件为:94℃预变性4 min，然后94℃45 s，44℃45 s，72℃1 min，共循环30次，最后72℃延伸10 min。取PCR产物5 μl在1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色成像。阳性结果的PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果在GenBank上的BLAST进行比对。

2　结果

2.1菌株来源及分布50株鲍曼不动杆菌主要见于神经外科、ICU、呼吸内科，检出株数分别为15株（30.0%）、10株（20.0%）、9株（18.0%）。标本类型为痰标本34株 （68.0%）、创面分泌物标本2株（4.0%）、血标本2株（4.0%）、尿液标本 5株（10.0%）、引流物标本2株（4.0%）、以及来自神经外科患者病床栏杆表面标本5株（10.0%）。

2.2药敏试验结果50株鲍曼不动杆菌均呈多重耐药，对临床常用12种抗菌药物耐药率达70.0%～100.0%，见表1。

表1　50株多重耐药鲍曼不动杆菌对抗菌药物的药敏试验结果

2.3耐消毒剂基因qacEΔ1检测结果50株鲍曼不动杆菌中有21株携带耐消毒剂基因qacEΔ1，阳性率为42．0%，其余菌株均为阴性。耐消毒剂基因qacEΔ1的PCR检测结果见图1。将阳性结果的PCR产物在GenBank上进行比对，符合qacEΔ1基因序列，见图2。

图1　多重耐药鲍曼不动杆菌耐消毒剂基因qacEΔ1检测结果

3　讨论

近年来鲍曼不动杆菌在医院环境中分布很广泛，成为医院内感染的重要病原菌，尤其在ICU及神经外科等重点科室，鲍曼不动杆菌对常用抗菌药物的耐药率也呈现逐渐上升趋势，因此引起临床医生及微生物专家的关注。本文研究结果显示，在分离的50株鲍曼不动杆菌中，ICU为10株 （20．0%）、呼吸内科为9株（18．0%）、神经外科为15株（30．0%），所有菌株对临床常见的12种抗菌药物的耐药率均较高，最高达100．0%，由此可见临床分离的鲍曼不动杆菌耐药情况较严重，与钟海波等［2］研究的60株鲍曼不动杆菌均呈多重耐药，对临床常用抗生素耐药率达73．4%～98．3%的耐药情况相似，这与患者病情较重的科室长期使用抗生素、免疫抑制剂、长期住院、机体免疫力低下、频繁使用各种导管等因素有关。对于多重耐药菌感染的患者，除了使用抗生素，使用消毒剂也是控制感染的有效措施之一。

随着消毒剂的大量广泛使用，由于使用不当使细菌长期接触亚抑制浓度的消毒剂，从而使耐消毒剂的菌株被筛选出来［3］。同时，由于鲍曼不动杆菌的多重耐药菌株广泛存在，很容易产生抗菌药物和消毒剂均无法杀灭的超级细菌，从而把医院感染控制推向更为严峻的境地［4］。

图2　多重耐药鲍曼不动杆菌耐消毒剂基因qacEΔ1测序结果

细菌对消毒剂抗性机制可分为天然耐药性、通过获得质粒转座子、发生基因突变而产生对消毒剂的耐药性或产生降解或抵抗抗生素的酶。目前，消毒剂抗性基因研究最多的是季铵盐类消毒剂耐药基因，即qac基因。qac基因家族包括qacA、qacB、qacC、qacD、qacE、qacF等，基因通过表达病原菌多种化合物外排泵而呈现耐药。姜梅杰等［3］报道，46株多重耐药鲍曼不动杆菌中，93.5%携带qacEΔ1基因。说明临床鲍曼不动杆菌菌株携带qacEΔ1基因是普遍现象。质粒上qacEΔ1-sull基因呈高携带率，提示鲍曼不动杆菌可能易于在菌株之间进行基因抗性传播。鲍曼不动杆菌作为临床主要致病菌之一，对qacEΔ1基因的携带率较高。本文研究50株多重耐药鲍曼不动杆菌中携带qacEΔ1基因的有21株，阳性率为42.0%，低于钟海波等［2］研究的分离自广州医学院第一附属医院的鲍曼不动杆菌携带的耐消毒剂基因qacEΔ1的阳性率为100%的报道。这可能与地区差异有关，但本文研究中42.0%的阳性率说明携带耐消毒剂基因qacEΔ1的多重耐药鲍曼不动杆菌仍存在一定的比例，不容忽视。本文研究还发现50株多重耐药鲍曼不动杆菌中，有5株痰液标本中的多重耐药鲍曼不动杆菌与神经外科患者病床栏杆表面的多重耐药鲍曼不动杆菌药敏试验结果相同，且均携带有耐消毒剂基因qacEΔ1。说明患者痰液经飞沫传播至环境中，对消毒剂的敏感性降低。另外鲍曼不动杆菌能够形成生物膜，更有利于菌株在环境中存活，促进了菌株的播散，医护人员手卫生不到位，频繁接触物体表面容易导致医院感染爆发事件的发生［5，6］。

综上所述，山西太原两所三甲医院多重耐药鲍曼不动杆菌的耐药情况非常严重，而且耐消毒剂基因的携带率较高，临床应当根据细菌药敏试验结果正确使用抗菌药物，避免抗菌药物过度使用，加强细菌耐药性检测和相关耐药基因分析，开展分子临床流行病学研究，分析临床菌株对消毒剂耐药与菌株医院内播散的关系，对于指导医院正确落实消毒隔离等感控措施具有非常重要的意义。

1陈佰亿，何礼贤，胡必杰，等.中国鲍曼不动杆菌感染诊治与防控专家共识.中华医学杂志，2012，92:76-85.

2钟海波，伍晓峰，林建濂.广州三所医院鲍曼不动杆菌携带耐消毒剂基因及耐药基因的调查.中国医药，2014，9:575-579.

3姜梅杰，冯莉，张福森.多重耐药鲍曼不动杆菌中氨基糖苷类修饰酶基因及qacEΔ1基因的研究.中华临床医师杂志，2012，6:3062-3064.

4Soumet C，Fourreau E，Legrandois P，et al.Resistance to phenicol compounds following adaptation to quaternary ammonium compounds in Escherichia coli.Vet Microbiol，2012，158:147-152.

5Wisplinghoff H，Schmitt R，Wohrmann A，et al.Resistance to disinfectants in epidemiologically defined clinical isolates of Acinetobacter baumannii.J Hospital Infection，2007，66:174-181.

6刘文秀，崔红霞，韩爽，等.鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌qacEΔ1基因检测及消毒剂抗性研究.实用检验医师杂志，2015，7:138-142.

（本文编辑:李霦）

Multi-drug resistant Acinetobacter baumannii resistant and carry disinfectant-resistant gene research

WANG Zheng-lan，LI Lin-ping，LI Xue，et al.Department of Hospital Infection-Control，Shanxi province People＇s Hospital，Taiyuan 030012，China

【Abtract】ObjectiveTo understand the situation of disinfectant-resistant gene and drug resistance of multi-drug resistant Acinetobacter baumannii.Methods50 strains multi-drug resistant Acinetobacter baumannii were collected in two grade third A class hospitals of Shanxi province from January 2014 to February 2015.The sensitivity of antibacterial agents were tested by K-B method.Disinfectant resistant gene qacEΔ1 was detected by polymerase chain reaction.Results50 strains multi-drug resistant Acinetobacter baumannii were mainly distributed in department of neurosurgeons，ICU and department of respiration，which were 15 strains（30.0%），10 strains（20.0%），9 strains（18.0%），respectively.There were 34 strains sputum specimens（68.0%），2 strains surgical wounds specimens（4.0%），2 strains blood specimens（4.0%），5 strains urine specimens（10.0%），2 strains drainage specimens（4.0%）and 5 strains specimens of bed handrail in department of neurosurgeons patients（10.0%）in 50 strains multi-drug resistant Acinetobacter baumannii.Drug resistance of 50 strains multi-drug resistant Acinetobacter baumannii to ampicillin/sulbactam，levofloxacin，ceftazidime，cefoperazone/sulbactam，imipenem were 96.0%（48/50），70.0%（35/50），100.0%（50/50），100.0%（50/50），98.0%（49/50），respectively.There were 21 strains multi-drug resistant Acinetobacter baumannii with disinfectant-resistant gene qacEΔ1 in 50 strains multi-drug resistant Acinetobacter baumannii，and the positive rate was 42.0%.ConclusionThe drug resistant situation of multi-drug resistant Acinetobacter baumannii is very serious，and carry disinfectant-resistant gene qacEΔ1.Therefore，it should be strictly regulate use of antimicrobial agents，and take corresponding measures to preventing epidemic outbreak of multi-drug resistant Acinetobacter baumannii in hospital.

Multi-drug resistant bacteria；Acinetobacter baumannii；Drug sensitive test；Disinfector；Disinfectant-resistant gene；qacEΔ1；K-B method

山西省卫生厅科技攻关项目（201301031）

李临平，E-mail:wzl933@126.com

10.3969/j.issn.1674-7151.2015.04.003

（2015-11-10）