罗布麻愈伤组织诱导和植株再生研究

李瑶，黄国庆，孙尧，王雷，吴琼（黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨150090）

罗布麻愈伤组织诱导和植株再生研究

李瑶，黄国庆，孙尧，王雷，吴琼
（黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨150090）

取罗布麻（Apocynum venetum L.）无菌苗中的叶、茎作为外植体，研究了不同激素组合对愈伤组织及不定芽分化的影响。结果表明：在多个激素浓度组合的培养基中，罗布麻的叶和茎的愈伤组织诱导率均能够达到100%；但进行不定芽分化时，茎来源的愈伤组织在不同激素配比的培养基中有不定芽分化，最高分化率可达到56.7%。因此，在构建罗布麻再生体系时，选择罗布麻茎段作为外植体，在培养基MS+6-BA 1.0m g/L+NAA 0.2m g/L中、光强2 500lx，每天光照时间12h、25±3℃的培养条件下诱导愈伤组织，并转接到同样的培养基中进行不定芽分化的诱导，最后在1/2MS培养基中加入适量的NAA进行生根培养。

罗布麻；愈伤组织；不定芽分化

罗布麻（Apocynum venetum L.），别称红麻、茶叶花、红柳子等，为夹竹桃科罗布麻属植物［1］，在我国新疆、青海、甘肃、宁夏、内蒙古、山东等省区均有分布［2-3］。罗布麻是一种抗逆性极强的植物，适于多种气候和土质，可生长于河岸、海滨盐地、干旱内陆地等。罗布麻的纤维价值极高，它的茎秆纤维可供纺织、造纸［4-5］。除此之外，罗布麻还有很高的药用价值，它含有多种有效的化学成分，根、茎、花、叶均可入药，具有降血脂、降血压、抗炎、抗过敏等多种效用［6-7］。罗布麻是一种集盐碱地绿化、纤维价值、药用价值于一体的野生优良水土保持植物，对于荒漠化的治理具有积极意义［8］。

野生状态下的罗布麻种子繁殖成活率不高、生长迟缓、成林时间较长［9］。而且，野生罗布麻的质量不稳定［10］。在取材时，对其生长的土壤环境也会造成深层次的破坏［11］。目前，也曾有人工栽培的报道，但在实际操作中受到环境因素的限制，且种子繁殖技术出苗率低，生长周期长［12］。鉴于此，本研究以罗布麻幼苗的茎段、叶片作为外植体，探讨愈伤组织诱导、不定芽再生及生根诱导的最佳条件，为种苗的快速繁殖及进一步的转基因操作奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1试验材料

吉林省采集的野生罗布麻种子，消毒后接种于MS培养基中，所得无菌苗的幼嫩茎段作为外植体。

1.1.2培养基

表1　用于罗布麻组织培养的培养基Tab.1 Tissue culture m edium s fo r apocynum

罗布麻为耐盐植物，选择高盐培养基MS培养基作为构建罗布麻再生体系的基本培养基［13］。添加生长素NAA（0.1～0.4mg/g）与细胞分裂素6-BA（0.5～2.0mg/g）配合诱导愈伤组织及不定芽的分化，具体激素组合见表1［14-15］。采用1/2MS培养基并添加生长素NAA（0.1～0.4mg/g）进行生根培养的诱导（见表2）［16-17］。

表2　生根诱导培养基Tab.2 Root induction cultu re medium

1.2方法

1.2.1无菌苗的获得

选取成熟饱满的罗布麻种子，放于10%的次氯酸钠溶液中浸泡消毒5m in，用无菌水冲洗5～6次，接种于MS培养基上，每瓶5个，置于光强2 500lx、光照时间16h，温度25±3℃的光照培养箱中进行培养，待无菌苗长至7cm左右时，取其茎段用于罗布麻再生体系的构建。

1.2.2愈伤组织诱导

取无菌苗的茎段及叶片，剪成一定大小（茎段0.5cm左右、叶片0.04cm2左右），接种于表1中相应的各培养基中进行愈伤组织的诱导。每瓶接种10个外植体，每个浓度接种3瓶共计30个，培养条件为光强2 500lx、光照时间12h，温度25±3℃［14］。

1.2.3不定芽的分化

待愈伤组织增殖至直径约0.5cm时，挑取新鲜、质地紧密的愈伤组织转接到表1的各培养基中，进一步进行不定芽的诱导。每瓶接种10个外植体，每个浓度接种3瓶共计30个，培养条件为光强2 500lx、光照时间12h，温度25±3℃［14］。

1.2.4不定根的诱导

待罗布麻分化出不定芽后，取芽丛中高约3～4cm的不定芽剪下，接种于生根培养基上进行生根诱导。每瓶接种7个或8个不定芽，每个浓度4瓶共计30个，培养条件为培养条件为光强2 500lx、光照时间12h，温度25±3℃［18］。

1.2.5结果统计

愈伤组织诱导率（%）=愈伤块数/接种个数× 100；不定芽分化率（%）=出芽愈伤块数/愈伤个数×100；不定根诱导率（%）=生根个数/不定芽个数× 100。

2　结果与分析

2.1愈伤组织诱导结果

MS培养基添加生长素NAA与细胞分裂素6-BA诱导愈伤组织。在激素施用的浓度范围内，罗布麻茎段及叶片均有愈伤组织发生。外植体接种3～4d后，叶片颜色变淡、拱起，茎段出现节状增粗、失绿；7d后，颗粒状愈伤组织从切面处长出，继而长满外植体表面，使茎段及叶片发生不同程度的膨大（见图1）。罗布麻茎段在9个不同激素组合梯度培养基中，有6种激素组合的诱导率达到了100%，具体结果如表3所示。罗布麻叶片尽在编号4的激素组合下诱导率达到100%，具体结果见表4。由此可知，罗布麻的茎和叶均可作为外植体材料诱导愈伤组织，其中，使用茎段诱导愈伤组织效果更佳。

图1　愈伤组织Fig.1 Callus

表3　罗布麻茎段诱导愈伤组织结果统计Tab.3 Apocynum stem callus statistical resu lts

表4　罗布麻叶片诱导愈伤组织结果统计Tab.4 Apocynum leaves callus sta tistical results

2.2不定芽分化结果

挑取愈伤组织进行不定芽分化诱导培养，10d后，有红色不定芽从茎段的愈伤组织上分化，而叶片的愈伤组织则未见不定芽分化。5d后，不定芽开始形成芽丛（见图2）。不定芽分化诱导的具体结果如表5所示。由此可知，茎段产生的愈伤组织，在培养基MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L中，分化率最高，可达到56.7%。

图2　茎愈伤组织上的不定芽Fig.2 Adventitious buds from callus o fstem

2.3生根诱导结果

不定芽生根培养是在1/2MS培养基上加入NAA进行诱导。在4个NAA供试浓度下，不定根的发生率均可达到100%。不定根健壮，长势较好。

根据试验结果可知，在构建罗布麻再生体系时，可选择罗布麻茎段作为外植体，在培养基MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L中、光强2 500lx，每天光照时间12h、25±3℃的培养条件下诱导愈伤组织，并转接到同样的培养基中进行不定芽分化的诱导，最后在1/2MS培养基中加入适量的NAA进行生根培养。

表5　罗布麻茎段诱导不定芽分化结果统计Tab.5 The statistical results of induced apocynum stem bud differentiation

3　结语

本试验采用罗布麻组织培养中较为常用的MS作为基础培养基，添加不同组合和配比的生长素NAA及细胞分裂素6-BA，以罗布麻无菌苗的茎段及叶片为外植体进行罗布麻植株再生的研究。根据罗布麻愈伤组织诱导、不定芽分化及不定根诱导的试验结果，可以得出构建罗布麻再生体系的最佳条件，即选择罗布麻茎段作为外植体，在培养基MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L中、光强2 500lx，每天光照时间12h、25±3℃的培养条件下诱导愈伤组织，并转接到同样的培养基中进行不定芽分化的诱导；生根培养可选择在1/2MS培养基中加入适量的NAA。在这一过程中，罗布麻愈伤组织诱导率可达到100%，不定芽分化率可达到56.7%，不定根的诱导率可达到100%。由此可知，罗布麻愈伤组织诱导及生根诱导相对较容易，提高不定芽分化率是建立高效再生体系的关键。

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Research on Apocynum Callus Induction and Plant Regeneration

LIYao，HUANGGuo-qing，SUNYao，WANGLei，WUQiong
（InstituteofAdvanced Technology，Heilongjiang Academy ofSciences，Harbin 150090，China）

Thispaper takes the leaves，stemsofapocynum ofno vaccine asexplants to study the effectof different hormones on callus and adventitious bud differentiation.The results showed that a combination of hormone concentrations inmultiplemedia，callus induction rateofapocynum leaves and stems could reach 100%；butwhen adventitious buds，stems sources callus bud differentiation in culture has different hormone combinations，the highestdifferentiation rate reached 56.7%.Therefore，when constructing apocynum regeneration system，apocynum stem segmentswere selected asexplants，in themedium MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L，the light intensity 2500lx，day light time 12h，25 callus culture conditions±3℃and transferred to the samemedium to induce differentiation ofadventitiousbuds.In themoderate NAA addition of1/2MSm medium，itwas cultured by rooting.

Apocynum；Callus；Adventitiousbuds.

S563.7

A

1674-8646（2015）05-0015-03

2015-03-09

李瑶（1987-），女，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，工程师，主要从事植物基因工程研究。