亳州产丹参药材UPLC-MS指纹图谱研究*

王　洋，石　喆，陈　涛，李　正，崔维利，李　进（天津中医药大学第一附属医院，天津300193）

亳州产丹参药材UPLC-MS指纹图谱研究*

王洋，石喆，陈涛，李正，崔维利，李进
（天津中医药大学第一附属医院，天津300193）

［目的］研究和建立亳州产丹参药材的超高效液相色谱-质谱联用技术（U PL C-M S）指纹图谱，考察不同批次丹参药材的质量稳定性，为全面的评价其整体质量提供依据。［方法］采用U PL C-M S法分别对水溶性成分和脂溶性成分进行测定，对10批样品的相似度进行计算分析；对共有峰进行标定，并通过M S数据对色谱峰进行指认。［结果］建立了10批亳州产丹参药材中水溶性成分和脂溶性成分的U PL C-M S指纹图谱，标定共有峰18个，其中水溶性成分8个，脂溶性成分10个，鉴定了其中9个色谱峰的化学成分，10批样品的相似度均大于0.90。［结论］该方法准确可靠、重现性好，可以用于丹参药材的整体质量评价。

丹参药材；液质联用；指纹图谱；质量控制

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.07.14

丹参为唇形科植物丹参（Salviamiltiorrhiza Bge.）的干燥根和根茎，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痛的功效［1］。丹参中主要包括水溶性的丹参酚酸类和脂溶性的丹参酮类成分［2］。现代研究表明，丹参具有多种药理作用，特别是在治疗心脑血管疾病时［3-7］，其时常作为原料药单一使用或与其他药物配伍组成复方使用［8-13］。丹芪偏瘫胶囊为国家中药6类新药，由丹参、黄芪、赤芍等14味药物组成，主要用于脑梗死的恢复期［14-15］，丹参为其中君药，主要有效成分既有酚酸类成分，又包括脂溶性的丹参酮类成分。

丹芪偏瘫胶囊中丹参的产地已固定为安徽亳州，目前丹参药材的企业质量控制方法为2010版《中国药典》，采用高效液相色谱（HPLC）法对药材中丹酚酸B和丹参酮IIA进行含量测定。而中药作为复杂混合体系，其成分组成复杂，仅以其中的某几个成分为指标很难全面的表征其化学特征和控制整体质量。指纹图谱技术可以对中药中的化学成分进行全方位的表征，这正好与中医强调的整体观念相吻合［16］。本研究采用快速、高效且定性准确的超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS），建立了10批安徽亳州产丹参药材的指纹图谱，对丹参中水溶性及脂溶性成分进行了全面分析，通过标准品对其中主要的指纹峰进行了指认，并通过相似度计算对样品进行了评价，为制定丹芪偏瘫胶囊中丹参药材的全面质量控制方法提供了科学依据。

1　仪器与试药

Acquity UPLC I-class超高效液相色谱仪、XEVOTQD三重四极杆串联质谱仪、电喷雾离子化源（ESI）、MassLynx数据处理系统（美国Waters公司）；AG135电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；KQ300DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

对照品丹酚酸B（批号111562-200504）、丹参素钠（批号110855-200809）、隐丹参酮（批号852-9903）、丹参酮Ⅰ（批号0867-200104）、丹参酮ⅡA（批号110766-200417）、迷迭香酸（批号111871-201001）购自中国药品生物制品检定所；紫草酸（批号20131203）购自上海永恒生物科技有限公司；丹酚酸A（批号MUST-13020701）、二氢丹参酮Ⅰ（批号MUST-13082317）购自成都曼思特生物科技有限公司；上述标准品的结构式如图1所示。试剂甲醇（德国Merck公司）、甲酸（美国Tedia公司）均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为自制超纯水。丹参药材由天津市石天药业有限责任公司提供（均采自安徽省亳州市），由天津中医药大学第一附属医院李进主任药师鉴定，为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。丹参药材的具体产地见表1。

图1　 9种丹参成分的结构式Fig.1 Structuresofnine chem ical constituents in Danshen

表1　安徽亳州不同地区产丹参药材Tab.1 Danshens’origin in AnhuiBozhou from different habitats

2　方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：ACQUITYUPLC®HSST3（2.1mm×100mm，1.7μm）。流动相：0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱，脂溶性成分：0～2min，25%～30%B；2～3min，30%～50%B；3～5 min，50%～60%B；5～10min，60%～70%B；10～15min，70%～80% B；15～16min，80%～25%B；16～18min，25%B；水溶性成份：0～3min，10%～19%B；3～7min，19%～23%B；7～9min，23%～30%B；9～11min，30%B；11～12min，30%～10%B；12～15min，10%B。流速：0.4mL/min；样品室温度：20℃；进样体积：5μL；柱温：水溶性成分30℃，脂溶性成分40℃。

2.2质谱条件电离源：ESI，水溶性成分负离子扫描，脂溶性成分正离子扫描。脱溶剂温度：400℃，脱溶剂气体流量：700 L/h，锥孔电压：50 V，锥孔气流量：50 L/h，毛细管电压：3 kV，离子源温度：150℃，质量扫描范围：m/z100～1000。

2.3溶液制备

2.3.1对照品溶液的制备分别取丹酚酸B、丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸A适量，精密称定，加50%甲醇分别制成约100μg/mL的对照品溶液；分别取二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA适量，精密称定，加甲醇分别制成约100μg/mL的对照品溶液，即得。

2.3.2供试品溶液的制备取丹参药材，粉碎，过2号筛，精密称定1.0g，置具塞三角瓶中，加入甲醇50mL，超声40min，过滤，蒸干，用甲醇溶解残渣并转移至50mL量瓶中，加甲醇稀释至50mL，过滤，取续滤液，即得脂溶性成分供试品溶液。取甲醇超声滤过后的药粉残渣，加入50%甲醇50mL，超声40min，过滤，蒸干，用50%甲醇溶解残渣并转移至50mL量瓶中，加50%甲醇稀释至50mL，过滤，取续滤液，即得水溶性成分供试品溶液。

2.4指纹图谱方法学考察

2.4.1精密度实验取样品S1 1份，按“2.3.2”项下

方法制备丹参水溶性及脂溶性成分供试品溶液，精密量取同一供试品溶液，连续进样6次，考察仪器的精密度。结果表明，色谱峰的相对保留时间的RSD均小于1.0%，峰面积的RSD均小于3.0%，说明仪器精密度良好。

2.4.2重复性实验取样品S1 6份，按“2.3.2”项下方法平行制备丹参水溶性及脂溶性成分供试品溶液各6份，考察方法的重复性。结果表明，色谱峰的相对保留时间的RSD均小于2.0%，峰面积的RSD均小于3.0%，表明方法重复性良好。

2.4.3稳定性实验取样品S1 1份，按“2.3.2”项下方法制备丹参水溶性及脂溶性成分供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样检测，考察供试品溶液的稳定性。结果表明，色谱峰的相对保留时间的RSD均小于1.5%，峰面积的RSD均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定［17-19］。

2.5指纹图谱的建立与共有峰的确定按“2.3.2”项下方法制备10批次的丹参水溶性及脂溶性成分供试品溶液，按“2.1”项色谱条件及“2.2”项质谱条件进行检测，建立丹参药材中水溶性成分及脂溶性成分的UPLC-MS总离子流色谱指纹图谱，如图2所示。将上述10批次药材的结果导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004A版），对亳州产丹参药材的水溶性成分及脂溶性成分的UPLC-MS总离子流色谱图谱进行匹配。标定匹配数目为10的色谱峰为共有峰，其中水溶性成分8个，脂溶性成分10个，且共有峰的总面积占总峰面积的90%以上。2.6指纹图谱相似度计算采用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004A版）进行相似度计算，结果见表2和表3。10批丹参药材的水溶性成分和脂溶性成分的相似度结果均大于0.90。说明10个批次丹参药材的化学轮廓比较接近，成分比较稳定。

表2　 10批药材水溶性成分指纹图谱相似度Tab.2 Fingerprrint sim ilarity ofphenolic acids inn 10 batch herbs

图2　典型的丹参药材UPLC-MS总离子流色谱指纹图谱（S1）Fig.2 TypicalUPLC-MS total ionic chromatographic fingerp rintsof Danshen（S1）

表3　 10批药材脂溶性成分指纹图谱相似度Tab.3 Fingerprrint sim ilarity of tanshinones in 10 batchesherbs

2.7指纹图谱色谱峰的确认采用对照品对指纹图谱中的色谱峰进行确认。按“2.1”项色谱条件及“2.2”项质谱条件，分别进样供试品溶液、对照品溶液，通过保留时间和质谱信息，确认色谱峰，结果见图2。

3　讨论

本研究通过采用UPLC-MS技术建立了安徽亳州产丹参药材的总离子流色谱指纹图谱。通过连续提取制备供试品溶液，主要考虑与丹芪偏瘫胶囊的制备工艺保持一致，以便能最大限度的反应药材的化学指纹特性。选择质谱作为样品测定的检测器，可以有效地克服紫外检测器的局限性以及蒸发光散射检测器的不稳定性，并且其具有更加准确的定性能力。在色谱条件的建立时考察了BEH及HSS T3两种型号的色谱柱，结果表明对于极性较大的丹参水溶性成分，HSST3具有更好的保留特点和更多的色谱峰数目。在流动相的选择上，分别考察了甲醇、乙腈、甲酸、乙酸等溶液的组合，兼顾考虑分离及化合物的电离效果，确定以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈溶液系统梯度洗脱效果最佳。质谱条件的优化主要是考虑主要化合物的响应情况，由于酚酸类化合物易产生［M-H］-离子，而丹参酮类化合物易产生［M+H］+离子，所以选择负离子模式对水溶性成分进行扫描，选择正离子模式对脂溶性成分进行扫描。通过文献检索发现，质量扫描范围为m/z100～1 000可以有效地满足丹参药材中小分子有机化合物的分析要求。在此基础上，再通过优化毛细管电压、锥孔电压等质谱工作参数，使供试品获得最大的离子响应。

中药指纹图谱可以全面的反应其整体化学信息，避免单一组分的局限性。本研究建立了丹芪偏瘫胶囊中君药丹参中水溶性及脂溶性成分的UPLC-MS总离子流色谱指纹图谱，共计标定共有峰18个，明确了其中9个色谱峰的成分。该方法准确可靠、重现性好，可以有效地控制丹参药材的整体质量。为从源头上保证丹芪偏瘫胶囊质量的稳定性提供了实验依据。

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（本文编辑：高杉，滕晓东）

UPLC-M S fingerprint of Salviam iltiorrhiza Bge.in Bozhou

WANGYang，SHIZhe，CHEN Tao，LIZheng，CUIWei-li，LIJin
（The FirstA ffiliated Hospitalof Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To study and establish the UPLC-MS fingerprintof Salviamiltiorrhiza Bge.（Danshen），to investigate the stability of differentbatchesof sample for comprehensive evaluation of the quality of Danshen.［M ethods］The fingerprintof Danshen（including water-soluble phenolic acids and lipophilic tanshinones）was applied to UPLC-MS，and the similarity of 10 batchesofsampleswas analyzed.The common peak was determ ined，and identified by the MSdata.［Results］The UPLC-MS fingerprintof Danshen wasobtained，and 18 common fingerprintpeakswere indicated（including8water-soluble phenolic acidsand 10 lipophilic tanshinones），and 9 of them were identified by comparison with reference standards，and the similarities of the 10 samplesweremore than 0.90.［Conclusion］The method is reliableand stable，which can beused for the comprehensiveevaluation ofDanshen.

Salviam iltiorrhiza Bge.；UPLC-MS；fingerprint；quality control

R284.2

A

1672-1519（2015）07-0437-05

天津市科技创新专项资金项目（06FZZDSH00 408）；天津市西青区科技创新专项计划项目（XQCXZX2012-006）；天津市西青区科技型中小企业发展专项资金项目（XQKC 2013-022）。

王洋（1981-），男，博士，主管药师，研究方向为中药体内外药物分析和中药药理学。

李进，E-mail:lijin@shitian.com。

（2015-02-25）