固肠胶囊对慢性溃疡性结肠炎大鼠炎症介质及结肠黏膜的影响

孙晓萍，唐　方（.天津市武清区中医医院，天津30700；.天津医科大学总医院中医科，天津30005）

固肠胶囊对慢性溃疡性结肠炎大鼠炎症介质及结肠黏膜的影响

孙晓萍1，唐方2
（1.天津市武清区中医医院，天津301700；2.天津医科大学总医院中医科，天津300052）

［目的］观察固肠胶囊对慢性溃疡性结肠炎（UC）大鼠血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-10（IL-10）水平及结肠病理组织的影响，探讨其可能作用机制。［方法］Wistar大鼠随机分为空白对照组、模型组、固肠胶囊高、中、低剂量组，采用三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇溶液及葡聚糖硫酸钠（DSS）联合应用复制大鼠慢性UC模型，于造模缓解复发期灌胃给药10 d，观察各组大鼠疾病活动指数（DAI），结肠黏膜损伤指数（CMDI）及病理组织学改变，酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清TNF-α、IL-10水平。［结果］与空白对照组比较，模型组DAI、CMDI评分及血清TNF-α水平显著升高（P＜0.01），IL-10水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，固肠胶囊能明显升高血清IL-10水平（P＜0.05），降低DAI、CMDI评分（P＜0.01）及血清TNF-α水平（P＜0.05），促进溃疡修复。［结论］固肠胶囊可通过抑制血清TNF-α表达、促进血清IL-10表达，抑制炎症进展，减轻结肠组织因过度免疫介导作用而导致的肠黏膜损伤而治疗慢性UC。

慢性溃疡性结肠炎；固肠胶囊；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-10

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2015.01.09

溃疡性结肠炎（UC）是以腹泻、黏液脓血便、腹痛为主要临床症状，以结肠黏膜慢性炎症和溃疡形成为病理特点的非特异性肠病，目前病因不明，常反复发作，现代医学对本病多采用柳氮磺胺吡啶结合皮质激素进行治疗，但疗效并不理想［1］，目前应用中医药治疗UC已成为一种重要的治疗手段，其治疗效果不断得到临床肯定［2-3］，其中固肠胶囊具有散寒清热、调和气血、涩肠止泻之功用，临床应用证实其治疗UC疗效显著，既往药效学研究证实该药具有抗炎、镇痛、抑制平滑肌收缩等作用，对慢性实验性结肠炎有促愈合作用，但其作用机制尚不明确，为进一步认识固肠胶囊治疗慢性UC的作用机制，笔者在成功复制慢性UC动物模型的基础上，观察了固肠胶囊对慢性UC大鼠血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-10（IL-10）及结肠病理组织学改变的影响。

1　材料

1.1动物SPF级雄性Wistar大鼠40只，体质量（200±20）g，由中国医学科学院医学实验动物研究所提供（合格证号：SCXK京2009-0004）。

1.2药物与试剂固肠胶囊由黄连、黄柏、诃子、肉豆蔻、厚朴、吴茱萸、建曲、肉桂、干姜、花椒、川芎、五倍子、牡蛎、乌梅组成，由天津中新药业集团股份有限公司提供（批号J002）。

5%2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，批号068k5001，美国Sigma公司），葡聚糖硫酸钠（DSS，分子量5 000，批号STF2213 REF BMS622，日本光和纯药株式会社），无水乙醇（天津江天化工技术公司），便潜血（OB）试剂［批号070815，（台资）珠海贝索生物技术有限公司］，大鼠TNF-α、IL-10酶联免疫试剂盒（批号65593028，65854010，Ebioscience）。

1.3仪器D-37520型低温离心机（德国），A-5082型酶标定量测定仪。

2　动物分组

40只大鼠按随机数字表法随机分为空白对照组、模型组、固肠胶囊高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组8只。

3　方法

3.1模型制备除空白对照组外，根据文献报道［4-6］，将TNBS与DSS联合应用进行造模：1）5%TNBS与50%无水乙醇以体积1∶1配成TNBS/乙醇混合液；

DSS用蒸馏水配成5%DSS水溶液。2）各组大鼠适应性饲养3 d，禁食不禁水24 h，称质量，采用10%水合氯醛（0.03 mL/kg）腹腔注射麻醉后，将8号导尿管轻轻插入肛门上端8 cm，按0.04 mL/kg（相当于TNBS剂量100 mg/kg），用1 mL注射器缓慢注入相应体质量比例TNBS/乙醇混合液，空白对照组注入相应体质量比例生理盐水，再注入0.5 mL空气，倒立5 min，仰卧归笼，自然苏醒与饮食。实验第10天后，以大鼠大便潜血“+”为标准，模拟慢性UC的缓解复发病程，给造模组大鼠5%DSS水溶液代替饮水自由饮用，每次24 h，空白对照组大鼠则饮用生理盐水，实验期间共复发2次。

3.2给药方法及标本采集各组大鼠自第1次复发时开始灌胃给药，给药剂量分别为固肠胶囊高剂量组1 500 mg/kg、中剂量组1 125 mg/kg、低剂量组750 mg/kg组，各组等效剂量相当于60 kg体质量成人每日临床用量的20、15、10倍。空白对照组和模型组大鼠灌胃1 mL生理盐水，每日1次，连续给药10 d。各组动物最后1次灌胃后，禁食不禁水24 h，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉全部杀检，腹主动脉采血，静置后3 000 r/min离心10 min分离血清，-20℃冰箱保存待测。剖取大鼠肛门至盲肠末端的结肠段，清理肠系膜及粘连组织，沿肠系膜纵轴剪开，冰生理盐水反复冲洗干净，平铺于滤纸上，记录结肠黏膜损伤情况待评分。取大鼠结肠病变最明显处组织一小部分，用4%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片，行苏木精-伊红（HE）染色进行病理组织学观察。

3.3DAI、CMDI评分，血清TNF-α、IL-10水平的测定观察记录大鼠精神状态、活动、皮毛色泽、体质量、大便性状及便隐血状况，按表1进行疾病活动指数（DAI）评分［7-8］；参照文献［9-10］，按表2进行结肠黏膜损伤指数（CMDI）评分。血清TNF-α、IL-10的检测采用酶联免疫吸附法（ELISA），具体步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。

表1　DAI评分表分

3.4统计学分析采用SPSS 18.0统计软件处理，计量资料采用均数±标准差（x±s）进行描述，正态分布数据组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较若方差齐采用LSD检验，若方差不齐采用Dunnett’s T3法；偏态分布数据组间比较采用秩和检验，组间两两比较采用Nemenyi检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

表2　CMDI评分表分

4　结果

4.1固肠胶囊对慢性UC模型大鼠DAI、CMDI的影响见表3。与空白对照组比较，模型大鼠DAI及CMDI评分均明显升高，但与模型组比较，固肠胶囊高、中剂量组DAI及CMDI评分显著降低。

表3　固肠胶囊对慢性UC模型大鼠DAI、CMDI的影响（x±s）分

4.2血清TNF-α、IL-10水平的影响见表4。与空白对照组相比，模型组血清TNF-α水平显著升高、IL-10水平显著降低，与模型组相比，固肠胶囊高剂量能显著降低血清TNF-α水平，中、低剂量有一定作用，但差异无统计学意义，固肠胶囊高、中剂量组与模型组相比血清IL-10水平显著升高。

表4　固肠胶囊对慢性UC模型大鼠TNF-α、IL-10的影响（±s）pg/mL

表4　固肠胶囊对慢性UC模型大鼠TNF-α、IL-10的影响（±s）pg/mL

注：与空白对照组比较，*P＜0．05，**P＜0．01；与模型组比较，△P＜0．05，△△P＜0．01。

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4.3固肠胶囊对慢性UC模型大鼠结肠组织病理学观察见图1。空白对照组结肠黏膜完整，腺体排列整齐，无溃疡及炎细胞浸润。模型组黏膜出现不同程度缺损和坏死脱落，溃疡形成，腺体缺失，杯细胞减少，广泛炎细胞浸润，纤维组织增生。固肠胶囊高剂量组黏膜基本修复或以瘢痕为主，可见新生黏膜和/或腺体增生，杯细胞增多，炎症减轻，纤维组织增生，呈修复改变。固肠胶囊中剂量组可见局限性溃疡或以瘢痕为主，溃疡基底部被纤维组织填充，溃疡边缘腺体增生，炎细胞浸润减轻，杯细胞增多，呈修复改变。固肠胶囊低剂量组黏膜仍见不同程度缺失，可见炎性细胞浸润，杯细胞减少，纤维组织增生。

图1　各组大鼠结肠组织病理学观察（HE染色×100）

5　讨论

目前已证实免疫因素与UC的病因和发病机制密切相关，其中细胞因子在UC发生发展中的作用已得到公认［11］，促炎细胞因子与抗炎细胞因子之间平衡失调被认为是UC的重要发病机制之一，促炎与抗炎细胞因子的免疫平衡被破坏，即导致肠道黏膜受到过强的炎症刺激，引起肠道损伤。与UC关系密切的促炎因子主要有IL-1、IL-6等，抑炎因子主要有IL-4、IL-10等，其中以炎性因子TNF-α，IL-10等较具代表性，因此选取此两项指标进行观察，以探讨固肠胶囊对慢性UC治疗作用的可能机制。

一般情况，模型大鼠在造模后普遍出现蜷卧少动，被毛松散，肉眼血便或黏液稀便、体质量下降等症状，DAI评分显著升高，经治疗后，固肠胶囊高、中剂量组DAI评分显著降低，肉眼观察高、中剂量组结肠大体形态较模型组溃疡数量减少、面积减小，黏膜充血水肿减轻。治疗后各组病理组织学改变亦可见差异性。

肠道细胞自身分泌和肠道黏膜淋巴细胞分泌的TNF-α作用于临近肠道细胞，调节肠道细胞增殖和凋亡，对维持肠道细胞数量和功能的动态平衡起重要作用［12］。病理情况下，肠道黏膜中多种炎性细胞均可大量分泌TNF-α［13］，既可诱导结肠上皮细胞大量凋亡，同时作为炎症介质参与黏膜固有层炎性反应和上皮细胞坏死脱落，造成结肠黏膜水肿和溃疡。IL-10能有效抑制活化的单核细胞和巨噬细胞转录产生IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等促炎细胞因子，参与维持肠道细胞因子网络平衡［14］；敲除小鼠IL-10基因能导致实验性结肠炎［15］，而应用IL-10灌肠治疗UC患者，能明显改善肠道黏膜炎性反应［16-18］，说明IL-10参与UC发病，在维持正常肠道黏膜免疫调节中发挥重要作用。本实验结果显示，与空白对照组相比，模型组大鼠血清IL-10水平明显降低（P＜0.01）、TNF-α水平显著升高（P＜0.01），而固肠胶囊高、中剂量组较模型组血清IL-10水平显著升高（P＜0.01，P＜0.05），与空白对照组水平接近；固肠胶囊高剂量组能显著降低大鼠血清TNF-α水平（P＜0.01），中、低剂量组能一定程度降低大鼠血清TNF-α水平。说明固肠胶囊可通过升高血清IL-10，抑制TNF-α等促炎细胞因子的表达，改善肠道黏膜的过度炎症反应，抑制炎性介质过度释放和免疫介导作用而导致的肠黏膜损伤、黏膜充血水肿和炎细胞浸润，促进结肠黏膜修复与溃疡愈合。

综上研究结果，提示固肠胶囊可通过提高某些抗炎细胞因子水平、降低某些促炎细胞因子水平发挥调节免疫平衡作用，降低肠道过度免疫反应，减轻肠道损伤，促进肠黏膜修复。从总体治疗效果看，其治疗作用具有一定剂量依赖效应，尤以固肠胶囊高剂量的药理活性和效果最佳，但是在实验结束时固肠胶囊组的黏膜评分及组织病理学改变仍高于空白对照组，提示在实验周期内模型大鼠病症尚未彻底治愈，适当延长治疗时间或可获得更佳疗效。

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Effects of Guchang capsules on expression of inflammatory mediators and colonic mucosa in ulcerative colitis rats

SUN Xiao-ping1，TANG Fang2
（1.Tianjin Wuqing Chinese Medicine Hospital，Tianjin 301700，China；2.Traditional Chinese Medicine Department，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China）

［Objective］To observe the effects of Guchang capsules on expression of expression of inflammatory mediators and intestinal mucosa in chronic ulcerative colitis（UC）rats，and explore its mechanism.［Methods］Wistar rats was randomly divided normal group，model group，Guchang cupsules high dose，middle dose and low dose group，2，4，6 trinitrobenzene sulfonic acid（TNBS）/ethanol solution and dextran sulfate sodium（DSS）was administrated to make chronic ulcerative colitis rats models.Rats were treatmented for 10 days，then，ats'disease activity index（DAI），colonic mucosal damage index（CMDI）and the histological changes were assessed．Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）methods was used to determine the expression of TNF-α and IL-10 in blood serum.［Results］Compared with normal group，DAI and CMDI sores，and TNF-α content of model group were significantly increased（P＜0.01）.IL-10 contentas significantly decreased（P＜0.01）.Compared with model group，Guchang capsules could significantly increase IL-10 content（P＜0.05），decrease DAI scores，CMDI sores（P＜0.01）and TNF-α content（P＜0.05），and promote the restoration of the facilitate ulcer.［Conclusion］By increasing IL-10 expression and decreasing TNF-α expression，Guchang capsules can limit inflammation progress and ruduce colonic mucosal damage induced by exceesive immune mediated role to treat UC consequently.

chronic ulcerative colitis；Guchang capsules；TNF-α；IL-10

R285.5

A

1673-9043（2015）01-0030-04

孙晓萍（1986-），女，硕士，从事中药药理及消化系统疾病研究。

唐方，E-mail：zhongyi3599@sina.com。

（2014-11-10）