复合木霉菌制剂防治葡萄灰霉病的效果研究

王承芳，陈 娟，2，旷文丰，毛伟力*（. 上海万力华生物科技有限公司，上海 20203；2. 上海交通大学，上海 200240）

复合木霉菌制剂防治葡萄灰霉病的效果研究

王承芳1，陈 娟1，2，旷文丰1，毛伟力1*
（1. 上海万力华生物科技有限公司，上海 201203；2. 上海交通大学，上海 200240）

通过马铃薯葡萄糖培养基（PDA）进行平皿对峙培养，从11个木霉（Tricheoderma Spp.）菌株中筛选出5 株对葡萄灰霉菌（Botrytis cinerea，BC）有拮抗活性的菌株。以 Tr85为目标菌株，分别与另 4个木霉菌株进行相容性测试，将相容性好的 Tr85/Tr178B、Tr85/Tr469A 和 Tr178B/Tr469A 进行混合，制成含 2×108个/g 孢子的复合菌或单菌株可湿性粉剂（WP），用于室内生测。经Tr85/Tr178B WP处理的葡萄叶片，对BC的防治效果（ERDC）显著高于（P≤0.05）其它复合菌株或单菌株WP处理。将Tr85/Tr178B WP继续用于2012和2013年在上海和山东的大田药效试验。在上海，当Tr85/Tr178B WP施用量为3.0 kg/hm2、 3.75 kg/hm2和5.25 kg/hm2时，各处理间对BC的ERDC没有显著性差异，但它们都显著高于（P≤0.05）2.25 kg/hm和化学农药50%腐霉利WP3.75 kg/hm2处理。在山东，Tr85/Tr178B复合菌WP施用量在3.00 kg/hm2、 3.75 kg/hm2、5.25 kg/hm2的处理与50%腐霉利WP3.75 kg/hm2的处理之间，对BC的ERDC差异不显著。但施用量为5.25 kg/hm2以及50%腐霉利WP3.75 kg/hm2（仅在2012年）对病害的ERDC显著高于（P≤0.05）用量为2.25 kg/hm2。

木霉菌；抗药性；灰霉病；防效

王承芳， 陈娟， 旷文丰， 等. 复合木霉菌制剂防治葡萄灰霉病的效果研究［J］. 生物灾害科学， 2015， 38（4）:333-338.

葡萄灰霉病（Botrytis cinerea）是世界性分布、发生严重的葡萄病害之一。在低温高湿的环境条件，特别当温度为 20～23℃，空 气相对湿度达 90%以上时发病严重［1］。随 着保护地葡萄种植面积的不断增大，灰霉病在保护地葡萄种植区域中的发生越来越严重［1］。目前，生产中对葡萄灰霉病的防治主要依靠化学农药。然而，长期大量地使用化学农药，促使了灰霉菌对许多化学农药产生抗药性，导致防治效果逐年下降［2-3］。 当前的研究调查表明，番茄灰霉菌对速克灵的抗药性非常强，其中采自大丰番茄的 D1-3菌株对速克灵的抗性水平以达到EC50＞263.78 µg/mL，E C95＞6 000 µg/mL，其 中 EC95是敏感菌株的 1 400 倍［4］，同时化学药剂的残留，严重污染了农产品和生态环境，危及了人畜的健康。

近年来通过筛选和开发有益微生物及其代谢产物，使生物防治日益成为防控多种植物灰霉病的一条有效途径［5-6］。但至今有关生防菌防治植物病害的研究多偏向于单一生防菌株对某个病害进行防治。在实际生产应用时，复合生防菌对环境的适应性、抗病范围、防效稳定性等方面比单一菌株更有优势，能够提高对植物病害的防治效果［7-8］。陈永珍［9］利 用复合生防细菌解淀粉芽胞杆菌和荧光假单胞菌防治烟草灰霉病，对单个菌株和复合菌株进行药效测试并发现，复合菌剂对灰霉病的防效显著高于单一菌剂。谯天敏［10］利 用铜绿假单胞菌和长枝木霉对竹梢枯病进行防治，结果表明两菌株分别对竹梢枯病有良好的防治作用，而将两个菌株混合使用，协同防效大大提高。

本研究从生防木霉菌株的筛选入手，测试了木霉菌单菌株与复合菌株制剂在温室和大田条件下，对葡萄灰霉病的防效差异性，为开发复合木霉菌制剂防治葡萄灰霉病，提供了可参考的数据和实践方法。

1　材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 葡萄灰霉病原菌 灰葡萄孢霉（ Botrytis cinerea）菌株Bc-2，是由上海万力华生物科技有限公司（上海万力华）从 上海浦东地区葡萄种植园的病株上分离得到，经 分子和形态学鉴定为葡萄灰霉病的病原菌。

1.1.2 木霉菌株 本实验中所测试的11个木霉菌株：T r85、T r115、T r178B、T r309、T r319B、T r407、T r422、Tr452B、Tr469A、Tr580、Tr606，均由上海万力从全国不同地区的葡萄种植园中所采集的土壤和植株样品，利用木霉菌选择性培养基（TSM）分离得到的，所有菌株均保存在4 ℃的PDA培养基中备用。TSM培养基：TSM培养基配方（单位为g/L）：MgSO4∙7H2O 0.2 g、KH2PO40.9 g、KCl 0.15 g、NH4NO31.0 g、葡萄糖3 g、氯霉素0.25 g、甲基磺0.3 g、五氯硝基苯0.2 g，玫瑰红0.15 g、琼脂20 g。

1.1.3 供试药剂 50%腐霉利可湿性粉剂：由日本住友化学株式会社生产。

木霉菌可湿性粉剂（WP）：将筛选出的菌株，经过发酵和剂型处理，制成含2×108/ g活孢子的木霉菌WP。

1.2 方 法

1.2.1 木霉菌对病原菌的平皿拮抗测试 采用两点对峙培养法，在直径为90 mm的 PDA平皿上，一侧接种直径为 5 mm Bc-2 的病原菌丝块，另一侧分别接种直径为 5 mm的 1 个木霉菌株的菌丝块，单独接种病原的平皿为对照，每个处理有3 个重复。将接种的平皿放置在 25 ℃恒温箱中培养 4 d后，分别记录每个处理的病原菌菌落生长直径，取平均值，并根据以下公式计算抑菌率：

1.2.2 木霉菌株相容性测试 在PDA培养基平皿中心接种1株直径为5 mm的目标木霉菌株的丝块，同时在其四周分别接种另四株直径为5 mm的木霉菌株的菌丝块，每个处理重复3次。将平皿放置在28 ℃的培养箱中培养3 d后，观察和记录目标木霉菌株与其它木霉菌株之间的相容性反应。2个菌株生长之间不产生抑菌条带（抑菌圈）的为相容性好，反之为不相容。

1.2.3 复合木霉菌制剂抑制葡萄灰霉病室内生测和大田药效测试 （1）室 内离体生测实验。采 叶龄一致、带有1～2 cm叶柄的葡萄叶片，用湿棉球包裹叶柄保湿并放置在培养皿中。将含2×108/g活孢子的木霉菌可湿性粉剂（WP），用无菌蒸馏水（SDW）进行梯度稀释至cfu为1×105的单菌株悬浮液，再将两个单菌株悬浮液按1∶1体积进行混合，配置成双菌株复合悬浮液。将各处理药液以及SDW（病原对照处理）均匀地喷洒到叶片正反面，每个处理10个叶片，重复4次。待药液干后，用无菌接种器取直径为5 mm的Bc-2病原菌丝块，接 种到各处理叶片的背面，将 叶背面朝上置于培养皿内，盖 上皿盖。将 培养皿置于设置为：温度25 ℃，湿度85%，12 h光暗交替，光强为10 000 Lux条件下人工气候箱中培养5 d后，观察和记录个处理叶片的病斑直径，取平均值。

（2）大 田药效实验。大 田药效测试点安排在上海市浦东新区傅嘉果蔬专业合作社和山东省泰安市岱岳区天平办事处南王家庄葡萄园，测试时间在2012和2013年。测试处理包括用2×108个/g复合木霉菌WP（Tr85/Tr178B）的处理1（Trt.1）: 2.25 kg/hm2；Trt.2: 3.00 kg/hm2；Trt.3:3.75 kg/hm2以 及Trt.4:50%腐霉利WP3.75 kg/hm2和Trt.5:清水对照（CK）。每个处理小区面积为30 m2，重复3次，采用随机区组排列。喷药处理共3次：1：葡萄花絮分离期；2：初花期；3：末花期。每亩用水量为50 L。在第1次施药前和第3次施药后7～10 d进行统计。调查每小区的全部花穗数，病情指数是以每个花穗的发病面积占整个花穗的百分比进行分级，0级：花序无病；1级：花序发病＜5%；3级：6～10%；5级：11～25%；7级：25～50%；9级：＞50%。病情指数和防治效果按以下公式进行计算。

2　结果与分析

2.1 平皿拮抗培养测试

通过将 11 个木霉株与病原菌株 Bc-2 进行对峙培养测试，4 d后观察到，不同的木霉菌株对 Bc-2 生长的抑制率差异较大（见表 1）。虽然所有测试的木霉菌株对 Bc-2 生长的抑制率都超过了 50%，但只有Tr178B，Tr469A和 Tr85 对 Bc-2 生长的抑制率超过了 75%，分别为 75.00%，77.78%和 83.33%，显著地高于（P≤0.05）其它菌株对 Bc-2 生长的抑制率。

表1　木霉菌株与BC-2平皿拮抗培养测试结果

2.2 木霉菌株相容性测试

通过以上平皿拮抗培养测试，选出 5 个对 Bc-2 生长抑制率强的木霉菌株 Tr422，Tr178B，Tr452B，Tr469A和 Tr85，并以 Tr85 作为目标菌株，测试 Tr85与其它 4 个菌株之间的相容性。结果显示（见表 2和图 1），Tr85 分别与 Tr469A和 Tr178B 菌株之间，以及 Tr469A和 Tr178B 之间相容性好，但与 Tr422 和 Tr452B 之间不相容。

表2　木霉菌株相容性测试结果

2.3 室内离体生测实验

根据木霉菌株相容性测试结果，选用了 Tr178B，Tr469A，Tr85单菌株和双菌株 WP 悬浮液进行室内离体生测试验。结果显示（见表3）， 经单菌株和双菌株WP 悬浮液处理的葡萄叶的灰霉病病情指数都控制在 25 以下，显著低于（P≤0.05）经 SDW CK处理叶片的病情指数， 防治效果 （ERDC， %） 都达到 55%以上。 其中， 经单菌株 Tr85 WP处理的叶片，对葡萄灰霉病的 ERDC为 66.42%，显著性地高于（P≤0.05）经其它单菌株 WP 和 Tr178B/Tr469A 以及 Tr85/Tr469A 双菌株WP 处理叶片的 ERDC，但显著低于（P≤0.05）经 Tr178B/Tr85 双菌株 WP 处理叶片的 ERDC（74.04%）。

图1　木霉菌株Tr85与其它4株菌株间相容性测试

表3　复合木霉菌株WP防治葡萄灰霉病室内生测实验结果

2.4 田间药效测试

将Tr85/Tr178B复合WP进一步用于防治葡萄灰霉病的田间药效试验，结果显示（见表3），虽然2012年两个试验点的病情指数（DS）都高于 2013 年，同时在对葡萄灰霉病的 ERDC 上，不同地区有一定的差异性，但 在同一地区，两 年的ERDC基本一致。在 上海，当 Tr85/Tr178B复合菌WP施用量为3.00 kg/hm2、3.75 kg/hm2和5.25 kg/hm2时，每个处理间对灰霉病的ERDC没有显著性差异，但它们都显著性地高于行改革（P≤0.05）用量为2.25 kg/hm2和化学农药50%腐霉利WP3.75 kg/hm2对灰霉病的ERDC。在山东地区，Tr85/Tr178B复合菌WP施用量在3.00 kg/hm2、 3 .75 kg/hm2、5 .25 kg/hm2的处理与50%腐霉利WP3.75 kg/hm2的处理之间，对灰霉病的 ERDC差异不显著。但施用量为 5.25 kg/hm2以及 50%腐霉利WP 3.75 kg/hm2（仅在 2012年）对灰霉病的ERDC 显著性地高于（P≤0.05）用量为2.25 kg/hm2。

表4　2亿活性孢子/克木霉菌WP防治葡萄灰霉病的效果

3　结论与讨论

对于大多数植物的病原菌生防菌的筛选，大部分是利用平皿对峙法进行菌株的筛选，但是单纯依靠一种方法来筛选某一种植物病害的生防菌是不太可靠的，且容易造成漏筛。据陈捷［11］介绍筛选木霉菌的作用机理多样，熊敏［12］利 用 11 株不同木霉菌株分别比较对峙培养法、病原菌存活率测定法、生防菌分泌物降解病原菌测定法、浸种抑菌萌发试验法及种苗接种活体筛选法对抑制黄瓜枯萎病尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的拮抗木霉菌的筛选效率。试验表明不同的筛选方法获得拮抗木霉菌菌株的结果差异较大。本 文通过平皿拮抗培养测试和室内离体生测试验两种室内筛选方式相结合，筛 选出 Tr85/Tr178B复合菌株。将 其制成含 2×108个/g活孢子的木霉菌WP，在 田间 2 年 4地的药效测试中，试 验效果稳定。因此，利用多种室内筛选方法有利于筛选出效果稳定的菌株。

在进行生防菌复合前，要对菌株之间的亲和性进行测试，因为菌株之间的亲和与否对植物病害的防治效果有一定的影响。如菌株之间亲和性好，通常有协同增效作用，如菌株之间亲和性不好，容易引起药效不稳定。陈志谊［13］研 究了拮抗细菌菌株之间亲和性和生物防治效果之间的关系。本文试验表明:在两个拮抗菌之间存在多种互作关系。当混合的 2 个菌株之间互作关系是亲和的，其生防效果有所提高。如Tr85 和 Tr178B，单独菌株的防效分别为 66.42%和 55.71%，而复合后达到 74.04%，提高了 7.62%。当复合的 2 个菌株之间互作关系是不亲和的，有 的菌株组合生防效果提高不明显甚至下降。如 Tr85 和 Tr469A单独菌株的防效分别为 66.42%和 59.62%，而复合后达到 67.48%，仅提高了 1.06%。因此，在生物防治的实际应用中，对不同的菌株进行亲和性测试，筛选出具有协同、增效作用的亲和性好的菌株，为生防菌组合菌剂具有较好的防治效果和生态适应性。

生物防治的防治效益和稳定性始终是限制生物防治发展的主要问题。由于单一生防菌株适应性有一定限制，使用复合菌则可拓宽木霉菌的适应范围，有利于抵抗叶表不良的环境条件，同时强化生防效应［8］。因为混合使用时菌株间的作用可能不只是简单的积加而具有了一定的协同性，提 高了与病菌的竞争能力。如 Tr85 和 Tr178B 分别为哈茨木霉和绿色木霉，两者的复合菌株的防治效果比其它组处理效果好。因此通过不同类型生防菌复合使用可以在一定程度上解决生防菌适应性差和防效偏低的问题。

灰霉病发生的严重程度受当年的天气影响比较大［1］。从文中比较 2012 和 2013 年，这两年的天气差异显著，导致病害整体发生区别较明显。2012 年阴雨天气多，空气湿度大，上海和山东两地的灰霉病的病情指数均较 2013 年高。因此，在预测到葡萄开花时期阴雨天气多时，应提前防治，以免灰霉病大规模爆发。

总之，目前木霉菌防治灰霉病的运用主要在试验室，在田间的具体应用较少。作者通过对木霉菌可湿性粉剂的田间药效研究，表明了在实际应用过程中利用混合木霉菌对葡萄灰霉病进行防治，取得优异的防治效果。使用 2.25 kg/hm2的使用剂量，能够保证其效果稳定。

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Bio-control of Grape Grey Mold by Using A WP-Formulation Mixed with Two Trichoderma Strains

WANG Cheng-fang1， CHEN Juan1，2， KUANG Wen-feng1， MAO Wei-li1*
（1. Shanghai WLH Bio-tech Corpration， Shanghai 201203， China； 2. Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240， China）

A screening test was conducted on petri dishes with potato dextrose agar （PDA）， and five Trichoderma strains were selected from 11 strains， which showed an antagonistic effect on inhibiting the growth of the pathogen of grape grey mold （Botrytis cinerea）. Using Tr85 as a target strain，a compatibility test was conducted with the other 4 strains. A wettable powder （WP） formulation containing 2x108/g spores was made with each of the signal strains or 2 strains， which were then used in an indoor bioassay. The grape leaves treated with the WP formulated with 2 strains of Tr85/Tr178B had a significantly higher（P≤0.05）efficacy rate （%） of disease control（ERDC） compared to those treated with each of the WPs formulated with a signal strain or other 2 strains. The WP formulation with Tr85/Tr178B was further used in field tests located in Shanghai and Shandong in 2012 and 2013. In Shanghai， there were no significant differences on ERDC among the treatments with the WP formulations of Tr85/Tr178B at 2.25 kg/hm2、 3.00 kg/hm2、5.25 kg/hm2， but the parameters of ERDC of each of the treatments were significantly higher（P≤0.05）than those with the treatments ofTr85/Tr178B WP at 2.25 kg/hm2and the chemical fungicide of 50% Procymidone WP at 3.75 kg/hm2. In Shandong， there were no significant differences on ERDC among the treatments of the WP formulations with Tr85/Tr178B at 2.25 kg/hm2、 3.00 kg/hm2、 5.25 kg/hm2a nd 50% Procymidone WP at 3.75 kg/hm2， but the parameters of ERDC with the treatments of Tr85/Tr178B WP at 5.25 kg/hm2and 50% Procymidone WP at 3.75 kg/hm2（only in 2012） were significantly higher（P≤0.05）than those with the treatment of Tr85/Tr178B WP at 2.25 kg/hm2.

Trichoderma； drug resistance； grape grey mold； mixed strains； efficacy rate of disease control

S436.631

A

2095-3704（2015）04-0333-06

2015-10-13

科技型中小企业技术创新基金（14C26213100929）、浦东新区科技发展基金创新资金（PKJ2014-NO1）和上海市科技型中小企业技术创新资金（1408H138600）

王承芳，女，工程师，硕士，主要从事生物农药研发，E-mail: wangfang3307@163.com；*通信作者：毛伟力，博士，E-mail:weilimao@hotmail.com。