高效液相色谱法测定食品模拟物中十种荧光增白剂迁移量

张云陈泽宇吕水源程立军唐庆强张信仁 三明出入境检验检疫局 福建检验检疫局技术中心

高效液相色谱法测定食品模拟物中十种荧光增白剂迁移量

张云1陈泽宇1吕水源2程立军1唐庆强1张信仁11 三明出入境检验检疫局 2 福建检验检疫局技术中心

建立了同时测定食品模拟物中十种荧光增白剂（FWA52、FWA135、FWA184、FWA185、FWA199、FWA236、FWA367、FWA368、FWA378、FWA393）迁移量的高效液相色谱荧光检测方法。水、3%乙酸溶液、10%乙醇溶液等水系模拟物采用二氯甲烷萃取目标化合物；橄榄油模拟物采用凝胶渗透色谱系统净化。样液采用Eclipse XDB-C18柱为分析柱，以四氢呋喃和5mmol/L乙酸铵溶液为流动相，液相色谱荧光检测器定性定量分析。结果表明：食品模拟物中10种荧光增白剂的线性相关系数均大于0.996，线性关系良好；不同添加水平的添加回收率范围在63.6%～99.6%之间；相对标准偏差范围RSD在2.4%～12.6%之间。

荧光增白剂；高效液相色谱；食品模拟物；迁移量

荧光增白剂(fluorescent whitening agents，FWAs)能够吸收紫外光，激发出可见的蓝紫色或蓝色荧光，从而提高塑料包装产品的艳度和白度[1]，在生产食品包装材料中广泛使用。由于FWAs普遍含有苯乙烯基结构和芳香胺基结构，具有潜在的致癌性，因此，欧盟[2]和我国[3]等均出台了对其使用进行限制的法律法规。如FWA184，欧盟法规2002/72/EC和我国国家标准GB 9685-2008都规定了其特定迁移量(SML)为0.6mg/kg。因此，研究和制定食品模拟物中荧光增白剂迁移量的测定方法有着重要的现实意义。

目前，国内外有关荧光增白剂迁移方法的报道，主要集中在纸张[4-5]和洗涤剂[6-7]中。未见食品模拟物中荧光增白剂迁移量检测方法的报道。本文根据国家标准GB/T 23296.1-2009[8]中的规定，建立了水、3%乙酸溶液、10%乙醇溶液和橄榄油等4种食品模拟物中荧光增白剂迁移量的液相色谱-荧光检测方法。本方法经验证适用于食品模拟物中十种荧光增白剂的检测，可满足国内外相关法规中荧光增白剂迁移量的检测要求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

FWA52，FWA135，FWA 184，FWA 199，FWA 236，FWA 367，FWA 368，FWA 378，FWA 393纯度均大于98%（美国Sigma-Aldrich公司）；四氢呋喃、乙腈、甲醇、环己烷、乙酸乙酯、无水乙酸铵均为色谱纯（美国Dikma公司）；二氯甲烷、冰乙酸为分析纯。

1.2 仪器与设备

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司），配备荧光检测器及色谱工作站；Autoclean凝胶渗透色谱仪（美国LabTech公司）；ST16R高速冷冻离心机（美国Thermo公司）；Milli-Q超纯水制备系统（美国Millipore公司）；电子天平(瑞士Precisa公司)；SPT-24A全自动氮气吹扫浓缩仪（北京斯珀特科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 食品模拟物的制备

本文按照GB/T 23296.1-2009规定，以水、3%乙酸溶液、10%乙醇溶液和橄榄油为食品模拟物，从迁移试验中获取目标物质，模拟样液应避光保存在4℃冰箱中。它们分别代表了水性食品（pH＞4.5）、酸性食品（pH＜4.5）、醇类食品和油脂类食品。

1.3.2 凝胶渗透色谱条件

GPC净化柱：S-X3 Bio-Beads(填料22g，粒径38～75μm)；流动相：环已烷-乙酸乙酯（1：1，V/V）；洗脱方式：等度洗脱；流动相流速：5mL/min；进样量：2mL；检测波长：254nm；净化程序：0～9min弃去洗脱液，9～20min收集洗脱液。

1.3.3 液相色谱条件

色谱柱：Eclipse XDB-C18柱(150mm×4.6mm，5☒m)，或其它等效色谱柱；柱温：40℃；进样量：50☒L；流速：1.0mL/min；检测波长：发射波长λex：360nm，激发波长λem：440nm。梯度洗脱，流动相及梯度洗脱程序见表1。

1.3.4 水基模拟物样品处理

量取水基模拟物10mL于50mL具塞离心管中，加入20mL二氯甲烷漩涡混匀1min，超声提取10min后，于高速离心机中10000r/min，离心5min，收集二氯甲烷层，残留物用20mL二氯甲烷再提取1次，合并二氯甲烷层于鸡心瓶中，40℃下旋转蒸发至干，残渣用2mL10%四氢呋喃水溶液洗脱，过膜待测。

1.3.5 橄榄油样品处理

称取橄榄油模拟物1g于10mL容量瓶中，用加入GPC流动相（环已烷-乙酸乙酯，1：1，V/V）溶解样品并定容至刻度，充分混匀后，用凝胶渗透色谱仪（GPC）进行分离，取9～20min的组分，于氮吹仪中45℃下氮气吹干，用1mL50%四氢呋喃水溶液洗脱，过膜待测。

2 结果与分析

2.1 流动相组分的优化

本试验对比了甲醇、乙腈和四氢呋喃作为有机流动相的分离效果，发现使用甲醇和乙腈作为有机流动相时，目标物质色谱峰拖尾较为严重；采用四氢呋喃配合甲醇作为有机流动相，不但可以使色谱峰完全基线分离，且峰型较好。考察了不同的流动相比例，结果表明，选择在表1梯度洗脱程序条件下可获得最佳的分离效果，且信号较强，峰形较好。10种荧光增白剂混合标准溶液的分离色谱图见图1。

2.2 水基模拟物萃取试剂的选择

表1 液相色谱梯度洗脱程序

荧光增白物质的提取多采用甲苯[6]、N,N-二甲基乙酰胺(DMF)[9,10]、三氯甲烷[11]等为提取剂。考虑到溶剂的互溶性，本文选择烷烃类溶剂作为提取试剂，对比了三氯甲烷和二氯甲烷提取出的荧光增白剂的回收率。结果表明，采用三氯甲烷作为提取试剂，对于FWA369和FWA393这两种荧光增白剂的提取效果不好，回收率水平不够理想。因此，本文选择二氯甲烷做为提取试剂。

2.3 凝胶色谱分离方法的优化

图1 十种荧光增白剂混合标准溶液的分离色谱图

图2 回收率-收集时间曲线图

表2 十种荧光增白剂的线性范围、相关系数、仪器检出限及方法定量限

荧光增白剂为脂溶性物质，用一般的萃取方法很难将其从橄榄油中分离出来，而凝胶渗透色谱以多孔凝胶对不同大小分子的排阻效应进行分离，大分子的油脂、色素、聚合物、蛋白等先淋洗出来，相对分子质量较小的化合物后淋洗出来，且柱填料和被分离试样无任何相互作用，因此，本文选择凝胶渗透色谱（GPC）作为分离橄榄油中荧光增白剂的方法。收集时间从6min起，以1min为步长，依次递增至样液完全从色谱柱上洗脱出来，回收率-收集时间曲线见图2。因此，本文将收集洗脱液的时间选在9～20min。

2.4 方法的线性范围、相关性及检出限

对于水基模拟物，在空白样液中加入标准系列（0.01、0.02、0.05、0.1、0.2μg/mL）按1.3.4方法处理后，依次上机测定。对于橄榄油样品，选用空白样品加入标准系列（0.1、0.2、0.5、1、2μg/g），再按1.3.5方法进行处理后，依次进样分析。以被测组分峰面积y对其质量浓度x(mg/L)作工作曲线。10种荧光增白剂在相应浓度范围内呈良好的线性关系。各种待测物的线性范围、相关系数（r）、仪器检出限（ILOD，S/N＞3）及方法定量限（MLOQ，S/N＞10）见表2。

2.5 方法的准确度和精密度实验

以不含荧光增白剂空白样品为本底，分别添加系列浓度的待测物标准溶液(添加水平见表3)，按照本文方法各进行6次平行试验，计算结果见表3。

3 结论

本研究采用高效液相色谱-荧光检测法，运用凝胶色谱技术，成功建立了食品模拟物中10种荧光增白剂迁移量的检测方法。各组分系列浓度曲线相关系数均大于0.996；回收率范围在64.3%～99.6%之间，相对标准偏差范围在2.4%～12.6%之间。本方法检测限低、线性关系良好、精密度和准确度高，可满足国内外相关法规中荧光增白剂迁移量的检测要求。

表3 四种食品模拟物中10种荧光增白剂的回收率和精密度(n＝6)

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国家质检总局科技计划项目(2013IK204)、福建省科技计划项目（2015Y0001）资助。】

张云（1984-），男，工程师，研究方向：食品及其接触产品安全检测研究。