罗格列酮对UVB诱导的小鼠光老化皮肤成纤维细胞MMPs表达和细胞外基质蛋白合成的影响

陈 亮， 毕 波， 曾继平， 刘天一， 朱宁文， 杨清建， 贾传龙， 卢勇舟， 周轶群， 杨 平

实验研究

罗格列酮对UVB诱导的小鼠光老化皮肤成纤维细胞MMPs表达和细胞外基质蛋白合成的影响

陈 亮， 毕 波， 曾继平， 刘天一， 朱宁文， 杨清建， 贾传龙， 卢勇舟， 周轶群， 杨 平

目的 探讨罗格列酮(RO)对光老化皮肤成纤维细胞(FBs)基质金属蛋白酶(MMPs)表达和细胞外基质(ECM)蛋白合成的影响。方法 采用cck-8法检测RO对FBs活性的影响。UVB反复照射诱导产生体外细胞光老化模型。造模结束24 h，Real-Time PCR检测MMPs的表达。造模结束48 h，western blotting检测弹性蛋白原和Ⅰ型胶原的表达。结果 低剂量RO对FBs的细胞活性无影响。UVB诱导的光老化FBs中，MMP-1，2，3，7和9的表达均显著升高。40 μM RO能降低UVB引起的MMPs过表达(P<0.05)；同时，能在蛋白水平上减缓UVB对FBs弹性蛋白原和Ⅰ型胶原合成的抑制(P<0.05)。 结论RO可降低光老化FBs中MMPs的表达，增加弹性蛋白原和Ⅰ型胶原的合成，维持光老化皮肤ECM成分的稳定，可作为对抗光老化的新手段。

罗格列酮; 光老化; 成纤维细胞;MMPs;ECM

紫外线等外源性因素引起的光老化在真皮表现为胶原降解增多，弹力纤维变性，从而导致皱纹产生和皮肤弹性减小[1]。这与皮肤成纤维细胞(fibroblasts, FBs)受UVB损害所导致的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)分泌增加，Ⅰ型胶原和弹性蛋白原合成减少密切相关[2-3]。近期许多研究指出，过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ , PPAR-γ)作为细胞核激素受体家族中的配体激活受体成员，能参与调控炎症反应，抑制如MMPs、NF-kB和AP-1等相关炎症因子的表达[4]。此外，还能干预氧化应激反应，在体内外的细胞衰老进程中起调节作用[5-6]。自2014年2～7月，我们利用此前构建的体外FBs光老化模型(stress-induced premature senescence, SIPS)[7]，使用已知的PPAR-γ特异性高效激动剂罗格列酮(Rosiglitazone, RO)，对光老化FBs的MMPs表达和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)蛋白合成的影响进行了研究。

1 材料与方法

1.1 小鼠皮肤FBs的获取 取1～3 d SPF级C57 BL/6小鼠，乙醚麻醉处死后，浸泡于75%乙醇中约10 min，用DMEM洗去残留乙醇，置于培养皿中；剪刀分离背部皮肤，剪下皮肤组织块约1 cm×1 cm，立即置于2%中性蛋白酶中，37 ℃恒温消化4 h；将皮肤取出，镊子分离表皮和真皮，将真皮剪碎后，置于0.1%胶原酶中，37 ℃恒温摇床消化2 h，至组织块基本消失。1500 r/min离心5 min，收集沉淀；弃上清，细胞以DMEM+10% FBS制成细胞悬液，吹打均匀后以约2×105/cm2的密度接种于培养皿，于37 ℃、5% CO2、100%饱和湿度的条件下培养；接近80%融合时进行传代，比例约为1∶4。

1.2 药物处理及光老化模型的建立 选用P2代细胞，使用含不同浓度RO的DMEM+10% FBS处理48 h。cck-8检测细胞活性，选取合适浓度。将细胞随机分成4组：正常组(不经RO预处理，不经UVB照射)，RO组(RO预处理，不经UVB照射)，UVB模型组(不经RO预处理，UVB照射)，UVB+RO组(RO预处理，UVB照射)。然后，采用此前本研究小组确立的方法，移去培养液，覆盖薄层磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS)，打开盖子，置于UVB灯管(Philips TL 20 w/01 RS lamp)正下方，进行首次照射，照射剂量(使用Lutron UV light meter测量)为120 mJ/cm2。照射完毕后，吸去PBS，加入10.0 ml DMEM+1% FBS继续培养，每隔12 h照射1次，120 s/次，共4次；末次照射完成后改为DMEM+10%FBS培养。

1.3 Real-time PCR 检测mRNA含量 末次照射24 h后，移除培养液，PBS冲洗3遍，加入1.0 ml Trizol(美国INVITROGEN 公司)，反复吹打数次，移至1.5 ml EP管中，加入氯仿400 μl，剧烈震荡30 s，冰上静置15 min，12000 r/min，4 ℃离心10 min。弃上清，加入75%乙醇洗涤，7500 r/min，4 ℃离心5 min。用40 μl DEPC水溶解RNA并用紫外分光光度计测定浓度。按每管2 μg RNA进行逆转录反应(TAKARA)，反应体系为Buffer 4 μl，dNTP 1 μl，Oligo 1 μl，逆转录酶1 μl，酶抑制剂1 μl，RNA及H2O共12 μl。30 ℃10 min，42 ℃60 min，4 ℃保存。Real-time PCR体系为mix 10 μl，上游及下游引物各1 μl，cDNA 1 μl，DEPC水7 μl。引物序列见表1。反应条件为热启动95 ℃10 min，随后95 ℃ 30 s，60 ℃30 s，72 ℃45 s，共40循环，仪器为StrataGene Mx3000 p(美国AGILENT TECHNOLOGIES公司)。

表1 引物序列

1.4 Western blotting检测蛋白表达 正常细胞或SIPS细胞末次照射48 h后，移去培养液，预冷PBS洗涤3次，培养皿移至冰上，加入蛋白裂解液500 μl，用1.0 ml针头反复吹打，转移至1.5 ml EP管中，冰上静置15 min。12 000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清，用BCA法测定蛋白浓度，取各个处理组蛋白提取液，调整蛋白浓度，与等体积2X上样缓冲液混合，煮沸并离心，电泳分离蛋白并将蛋白质转移至PVDF膜上，孵育袋中加入TEST稀释的collagenⅠ、tropoelastin( abcam 1∶500)和GAPDH( boster 1∶2000)，4 ℃孵育过夜。采用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(Jack-son 1∶ 2000)室温孵育2 h。ECL化学发光法显影和定影。

2 结果

2.1 RO对小鼠FBs活力的影响 为选择适合的RO浓度处理细胞进行后续试验检测，我们分别使用含有不同浓度RO的DMEM+10% FBS处理小鼠FBs，发现在足够长的处理时间内，较低浓度的(0～40 μM)RO对FBs的活性不产生影响，而较高浓度(80 μM)的RO会产生细胞毒性(图 1)，对细胞的增殖产生不利影响。因此，我们选择40 μM RO作为后续细胞处理的药物浓度。

2.2 RO可降低光老化FBs中MMPs的过表达 大量的研究证明，紫外线照射诱导皮肤成纤维细胞产生MMPs增多，主要包括MMP-1，-2，-3，-7，-9。为了检测RO对光老化FBs MMPs分泌的影响，40 μM RO处理后，体外建立光老化FBs模型，继续培养24 h。Real-time PCR检测显示，UVB模型组与正常组相比，MMP-1，2，3，7，9的表达分别增加11.3，3.1，8.9，3.3和5.0倍。而UVB+RO组与UVB模型组相比，除MMP-2之外，MMP-1，3，7，9的表达分别降低62.7%，60.4%，55.2%和36.4%，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3RO可增加光老化FBs中弹性蛋白原和Ⅰ型胶原的合成 Ⅰ型胶原的锐减和弹性蛋白的崩解是光老化皮肤皱纹产生和弹性丧失的主要原因[8-9]。为了检测RO对光老化FBs弹性蛋白原和Ⅰ型胶原合成的影响，40μMRO处理后，体外建立光老化FBs模型，继续培养48h，Westernblotting检测结果显示，UVB模型组与正常组相比，弹性蛋白原和Ⅰ型胶原表达明显下降，分别为正常细胞的25.2%和44.6%。而RO可以缓解UVB对FBs弹性蛋白原和Ⅰ型胶原合成的抑制，差异有统计学意义(图2，P<0.05)。

3 讨论

紫外线是引起皮肤外源性老化的重要环境因素，紫外线照射可以导致皮肤出现氧化应激反应，破坏皮肤真皮局部的结缔组织，使皮肤出现松弛、粗糙、色素沉积、弹性下降和皱纹增多等衰老表现[1]。FBs是皮肤真皮的主体细胞，己有大量研究证实，紫外线照射会诱导FBs产生MMPs增多(PK Vayalil, 2004年)并伴有ECM相关蛋白分泌减少[10-11]，这在皮肤光老化中起着重要作用[12]。随着生态环境的恶化，皮肤光老化现象愈来愈严重，影响着人们的身心健康，而相应的治疗措施也多种多样,但临床上被广泛接受的有效防止光老化的手段并不多，因此有关光老化发生的机制和防治成为目前的研究热点。

PPAR-γ属于配体激活的转录因子，可通过激活各种组织细胞中一系列基因表达，增加葡萄糖氧化，增加葡萄糖和脂质吸收，减少游离脂肪酸浓度，降低胰岛素抵抗[4]。作为具有强烈PPAR-γ激动活性的RO，临床上已广泛应用于2型糖尿病的治疗。近期研究表明，PPAR-γ除了可调节糖脂代谢，降低胰岛素抵抗外，还可以通过改善氧化应激损伤，调节慢性炎症反应来参与生物体内老化[13]，以及体外细胞的老化过程[5,14]。因此，本研究我们探讨是否PPAR-γ的特异性强效激动剂RO，同样可以改善光老化FBs，对光老化FBs的分泌功能产生影响。

图1 罗格列酮(RO)对小鼠成纤维细胞(FBs)活性的影响 a-e.不同浓度(0～80 μM)RO处理FBs 72 h后细胞生长情况 f.cck-8检测不同浓度(0～80 μM)处理FBs 72 h后细胞的活性 图2 RO对UVB诱导的光老化小鼠FBs弹性蛋白原和Ⅰ型胶原表达的影响 a. Western blot 检测各组弹性蛋白原的表达 b. Western blot 检测各组Ⅰ型胶原的表达

Fig 1 Effects of RO on metabolism of MDFs. a-e. cell growth of FBs at 72 h after RO (0～80 μM) treatment. f. to evaluate the proliferative cell activity of FBs detected by cck8 test at 72 h after RO (0～80 μM) treatment. Fig 2 Effects of RO on expressions of tropoelastin and collagen-Ⅰ in FBs induced by UVB. a. expression of tropoelastin in each group by western blot. b. expression of collagen-Ⅰ in each group by western blot.

在光老化的发生机制中，一方面紫外线照射可通过激活细胞表面的表皮生长因子受体、细胞因子受体和细胞内信号传导反应来上调核转录因子AP-1的表达，从而使MMPs的表达增加[8,15]。MMPs作为一组锌离子依赖的蛋白水解酶类，又可通过水解、破坏及重组ECM，导致皮肤结缔组织结构重建，最终引起皮肤光老化的多种临床表现(JH Chung, 2001年)。现已知的在紫外线诱导所引起的皮肤光老化过程中起决定性作用的MMPs，主要包括降解Ⅰ型、Ⅲ型胶原的MMP-1(胶原酶), MMP-2 (明胶酶A), MMP-7 和MMP-9 (明胶酶B) 以及降解基底膜中Ⅳ型胶原的MMP-3 (基质溶解素)[2,16]。而本实验结果显示，RO能明显减少紫外线诱导的光老化FBs中MMP-1，3，7，9的表达，这可能与PPAR-γ干扰NF-κB的激活以及下调p38 MAPK的磷酸化，从而使转录因子AP-1的生成减少有关[17]。另一方面，紫外线还可抑制多种ECM相关蛋白的合成，其中Ⅰ型胶原和弹性蛋白的减少，是导致各种光老化临床表现的主要原因[8-9]。Ⅰ型胶原是ECM中最主要的填充物质，占细胞外基质成分的85%～90%，为皮肤提供饱满的外观(JH Chung, 1997年)。而弹性蛋白主要由弹性蛋白原(tropoelastin)及相关骨架小分子交联形成，所形成的网架结构可使ECM具备一定的弹性和伸展性。在实验中我们发现，UVB作用后，FBs合成ECM相关蛋白的能力急剧下降，Ⅰ型胶原和弹性蛋白原分别下降至正常细胞的25.2%和44.6%，而RO的处理能明显缓解UVB导致的Ⅰ型胶原和弹性蛋白原的合成抑制，起到改善光老化皮肤FBs分泌功能的效果。

我们通过本实验发现，RO可降低UVB诱导的光老化FBs中多种MMPs的表达，使皮肤ECM的分解减少；同时可以增加弹性蛋白原和Ⅰ型胶原的合成，从而延缓皮肤FBs光老化进程，为皮肤光老化的治疗提出了一种新的可能。然而，RO对光老化FBs的其他方面，比如细胞增殖和周期等又会有何影响，其发挥作用的具体机制是什么，是单纯与PPAR-γ对NF-κB的干扰和p38 MAPK磷酸化的下调有关，还是主要通过其他途径产生作用，将成为我们接下来的研究工作重点。

[1] Gilchrest BA. Photoaging[J]. J Invest Dermatol, 2013,133(E1):2-6.

[2] Debacq-Chainiaux F, Leduc C, Verbeke A, et al. UV, stress and aging[J]. Dermatoendocrinol, 2012,4(3):236-240.

[3] 杨清建, 刘天一, 毕 波. 光老化过程中皮肤成纤维细胞的生物学改变[J]. 中国美容整形外科杂志, 2014,25(8):480-483.

[4] Ahmadian M, Suh JM, Hah N, et al. PPAR gamma signaling and metabolism: the good, the bad and the future[J]. Nat Med, 2013,19(5):557-566.

[5] Lee YH, Lee NH, Bhattarai G, et al. PPARgamma inhibits inflammatory reaction in oxidative stress induced human diploid fibloblast[J]. Cell Biochem Funct, 2010,28(6):490-496.

[6] Chung JH, Seo AY, Chung SW, et al. Molecular mechanism of PPAR in the regulation of age-related inflammation[J]. Ageing Res Rev, 2008,7(2):126-136.

[7] Zeng J, Bi B, Chen L, et al. Repeated exposure of mouse dermal fibroblasts at a sub-cytotoxic dose of UVB leads to premature senescence: A robust model of cellular photoaging[J]. J Dermatol Sci, 2014,73(1):49-56.

[8] Kohl E, Steinbauer J, Landthaler M, et al. Skin ageing[J]. J Eur Acad Dermatol Venereol, 2011,25(8):873-884.

[9] Langton AK, Sherratt MJ, Griffiths CE, et al. A new wrinkle on old skin: the role of elastic fibres in skin ageing[J]. Int J Cosmet Sci, 2010,32(5):330-339.

[10] Naylor EC, Watson RE, Sherratt MJ. Molecular aspects of skin ageing[J]. Maturitas, 2011,69(3):249-256.

[11] Kossodo S, Wong WR, Simon G, et al. Effects of UVR and UVR-induced cytokines on production of extracellular matrix proteins and proteases by dermal fibroblasts cultured in collagen gels%[J]. Photochem Photobiol, 2004,79(1):86-93.

[12] 胡孝辉, 高丰厚, 方 勇. 光老化作用对体外人皮肤成纤维细胞的影响[J]. 中国美容整形外科杂志, 2011,22(4):247-250.

[13] Chung JH, Seo AY, Chung SW, et al. Molecular mechanism of PPAR in the regulation of age-related inflammation[J]. Ageing Res Rev, 2008,7(2):126-136.

[14] Blanquart C, Barbier O, Fruchart JC, et al. Peroxisome proliferator-activated receptors: regulation of transcriptional activities and roles in inflammation[J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 2003,85(2-5):267-273.

[15] Rittie L, Fisher GJ. UV-light-induced signal cascades and skin aging[J]. Ageing Res Rev, 2002,1(4):705-720.

[16] 胡孝辉, 朱承睿, 高丰厚, 等. UVB诱导人皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原下调机制的研究[J]. 中国美容整形外科杂志, 2010,21(7):436-439.

[17] Mastrofrancesco A, Ottaviani M, Aspite N, et al. Azelaic acid modulates the inflammatory response in normal human keratinocytes through PPARγ activation[J]. Exp Dermatol, 2010,19(9):813-820.

Effects of rosiglitazone on the MMPs and ECM in UVB induced photo-aging mouse fibroblasts

CHENLiang,BIBo,ZENGJi-ping,etal.

(DepartmentofPlasticSurgery,HuadongHospitalAffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai200040,China)

Objective To investigate the influence of Rosiglitazone (RO) on the expression of matrix metalloproteinases (MMPs) and the synthesis of dermal extracellular matrix (ECM) proteins in photo-aging fibroblasts (FBs) induced by UVB. Methods The influence of RO on FBs proliferation was measured by cck 8 assay. The photo-aging model of FBs was induced by repeated UVB radiation. The influence of RO on the expression of MMPs of photo-aging mice FBs was evaluated by Real-Time PCR at 24 h after the last radiation and the synthesis of collagen I and tropoelastin were detected by western blotting at 48 h after the last radiation. Results No modification in the proliferative activity of FBs was observed at any dose tested up to 80 μM after 48 h. The UVB increased the expressions of MMP-1, 2, 3, 7 and 9 of FBs. But RO pretreatment inhibited the increasing expression of MMPs compared with the UVB group and the synthesis of tropoelastin and collagen I were increased by RO pretreatment in UVB+RO group compared with UVB group. Conclusion RO can maintain the metabolic balance of dermal ECM by decreasing the expression of MMPs and increasing the synthesis of tropoelastin and collagen I in photo-aging FBs. The novel application of RO may lead to innovative and effective anti-photoaging therapies.

Rosiglitazone; Photo-aging; Fibroblast; MMPs; ECM

国家自然科学基金资助项目(81272125；81301642)；上海市卫生系统优秀学科带头人培养计划资助项目(XBR2011033)；863基金资助项目(SS2014AA020705) 作者单位：200040 上海，复旦大学附属华东医院 整形外科(陈 亮，毕 波，曾继平，刘天一，杨清建，贾传龙，卢勇舟，周轶群，杨 平)；复旦大学附属华山医院 皮肤科(朱宁文)

陈 亮(1988-)，男，山东淄博人，硕士研究生. 通信作者：刘天一，200040，复旦大学附属华东医院 整形外科，电子信箱：tianyiliucn@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.08.017

R

A

1673-7040(2015)08-0500-04

2015-03-21)