亚麻枯萎病菌生长和产毒最适培养条件初探

宋喜霞

(黑龙江省农业科学院经济作物研究所，哈尔滨150086)

亚麻枯萎病是由尖孢镰刀菌亚麻专化型[Fusarium oxysporum Schl.f.sp.lini(Bolley)]引起的一种真菌病害，普遍发生在各亚麻种植地区。一般发病率为20%～30%左右，严重时可达40%以上，甚至绝产，严重影响亚麻产量和纤维质量[1]。镰刀菌毒素是镰刀菌产生的能引起植物萎蔫的一种代谢产物，是镰刀菌病害致病的主要原因之一[2]。

研究表明亚麻枯萎病毒素对亚麻种子萌发和胚根的生长有明显的抑制作用，可用作亚麻枯萎病抗性材料的筛选[3]。目前国内外小麦、辣椒、西瓜等作物已利用镰刀菌毒素对植物组织离体筛选抗逆种质，在筛选抗病资源和改良品质育种方面都取得了可喜成就[4－6]。本试验对尖孢镰刀菌亚麻专化性病菌的生长和产毒条件进行研究，明确尖孢镰刀菌亚麻专化性病菌生长和产毒的最适培养条件，为今后亚麻枯萎病的防治和利用毒素筛选亚麻枯萎病抗病品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株:黑龙江省兰西县亚麻田采集、分离、纯化的尖孢镰刀菌亚麻专化型强致病菌株(编号F4)。

1.2 试验方法

1.2.1 粗毒素滤液的制备

将F4菌株移接在PSA平板培养基上，于25℃下培养7天，沿菌落边缘打出直径6 mm菌片，接入装有150ml Richard培养液的250ml三角瓶内，每瓶接6片，置于30℃黑暗条件下，120r/min连续振荡培养15天。培养液过滤(先用4层纱布，再用2层滤纸)，滤液离心30 min(3000 r/min)，弃去沉淀，上清液煮沸15min，滤液保存在4℃冰箱内，供测备用。

1.2.2 胚根生长抑制率的测定方法

参照陆仕华 (1985)抑制胚根生长测定法[7]。将供试的亚麻种子用漂白粉溶液 (1:14)浸种3min，进行表面消毒。用无菌水冲洗3遍后放入铺有滤纸的培养皿中，加入亚麻尖孢镰刀菌毒素滤液15ml，25℃黑暗下培养，5天后测定并计算胚根生长抑制率。每个培养皿中放50粒种子，设3次重复，对照用等量清水处理。

胚根生长抑制率 (%)=(对照胚根生长长度－处理胚根生长长度)÷对照胚根生长长度×100

1.2.3 培养液的选择

将供试F4菌株在PSA培养基25℃下培养7天，沿菌落边缘打出6mm菌片，接种盛有150ml培养液的250ml三角瓶内，每瓶接6片，25℃培养15天，统计菌丝干重、孢子浓度和亚麻胚根生长抑制率。

(1)改良Czapek培养液:硝酸钠2g，硫酸亚铁2.5g，磷酸二氢钾1g，蔗糖30g，硫酸镁0.01 g，氯化钾0.5g，蒸馏水1000ml。

(2)Fries培养液:硫酸镁0.5g，蔗糖20g，酒石酸5g，硝酸1g，磷酸二氢钾1g，氯化钠0.1g，氯化钙0.13g，酵母浸膏1g，蒸馏水1000ml。

(3)Richard培养基:硝酸钾19g，氧化铁0.01g，磷酸二氢钾5g，蔗糖5g，硫酸镁0.5g，蒸馏水1000ml。

(4)Armstrong镰刀菌培养基:磷酸二氢钾1.1g，硫酸镁0.4g，葡萄糖20g，氯化钾1.6g，硝酸钙5.9g，硫酸锌0.2mg，三氯化铁0.2mg，硫酸锰0.2mg，水1000ml。

(5)MS无机盐+蔗糖培养液:MS无机盐培养基+3%蔗糖，蒸馏水1000ml。

(6)PD培养液:马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml。

1.2.4 培养温度对病菌生长和产毒的影响

选择最适合产生毒素的培养液，接种病菌后，分别置于5℃，10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃7个温度梯度处理下进行培养，培养15天，统计其菌丝干重、孢子浓度和对亚麻胚根的生长抑制率。

1.2.5 培养时间对病菌生长和产毒的影响

选择最适合产生毒素的培养液，接种病菌后，在最适温度下，分别培养10天、15天、20天、25天、30天、35天统计其菌丝干重、孢子浓度和对亚麻胚根的生长抑制率。

1.2.6 pH值对病菌生长和产毒的影响

PH值设3、4、5、6、7、8、9共7种处理。

1.2.7 光照条件对病菌生长和产毒的影响

24小时连续光照、12小时明暗交替、24小时连续黑暗，光照强度3000Lux。

2 结果与分析

2.1 培养液对病菌生长和产毒的影响

在6种不同培养液中亚麻尖孢镰刀菌均能生长和产毒，但6种培养液的菌丝生长、产孢能力、产毒能力差异显著，其中MS无机盐+蔗糖培养液最利于菌丝生长，其菌丝干重显著高于其他培养液，菌丝干重达到421mg/瓶，其次为改良Czapek培养液，其菌丝干重为386mg/瓶;Armstrong镰刀菌培养液最有利于孢子生长，孢子浓度显著高于其他培养液，为20.8×106个/ml，其次为改良Czapek培养液，孢子浓度为19.3×106个/ml;Richard培养液最有利于产毒，胚根的生长抑制率显著高于其他培养液，胚根的生长抑制率为58.9%，其次为改良Czapek培养液，对亚麻胚根生长的抑制率为45.8%，结果见表1。

表1 不同培养液对亚麻尖孢镰刀菌生长和产毒的影响Tab.1 Effect of different culture media on F.oxysporum growth and toxin production

2.2 培养温度对病菌生长和产毒的影响

在6种培养温度处理下菌丝生长差异显著，其中25℃最有利于菌丝生长，菌丝干重显著高于其他处理为，菌丝干重为384 mg/瓶;病菌在6种培养温度下孢子生长差异显著，其中25℃孢子浓度显著高于其处理，孢子浓度为12.5×106个/ml;病菌在6种培养温度处理下产毒能力差异显著，30℃条件下最有利于产毒，产毒能力显著高于其他处理，胚根生长抑制率达到64.4%，结果见表2。

2.3 培养时间对病菌生长和产毒的影响

在6种培养时间处理下菌丝生长差异显著，在25天时菌丝干重显著高于其他处理，菌丝干重为912mg/瓶;在6种培养时间处理下孢子浓度差异显著，在25天时孢子浓度显著高于其他处理，孢子浓度为19.6×106个/ml;在6种培养时间处理下病菌产毒能力差异显著，在25天时病菌产毒能力显著高于其他处理，对亚麻胚根生长抑制率达到75.6%，结果见表3。

表2 培养温度对亚麻枯萎病病菌生长和产毒的影响Tab.2 Effect of temperature on F.oxysporum growth and toxin production

表3 培养时间对亚麻尖孢镰刀菌生长和产毒的影响Tab.3 Effect of culture time on F.oxysporum growth and toxin production

2.4 pH值对病菌生长和产毒的影响

在7种处理条件下病菌菌丝生长、孢子浓度和产毒能力都差异显著，总体来看病菌在PH 6～7之间生长较好，最适PH值为7，在PH7时菌丝干重、孢子浓度和病菌产毒能力都显著高于其他处理。随着PH值的升高亚麻枯萎病病菌产毒能力升高，但增长速度缓慢，PH7时亚麻胚根生长抑制率达到最高为65.8%，之后随PH值升高，胚根生长抑制率下降，结果见表4。

表4 PH对亚麻尖孢镰刀菌生长和产毒的影响Tab.4 Effect of pH on F.oxysporum growth and toxin production

2.5 光照条件对病菌生长和产毒的影响

24小时连续黑暗条件下菌丝干重显著高于其他2种处理，为389 mg/瓶;24小时连续黑暗条件下孢子浓度显著高于其他2种处理，孢子浓度高为12.3×106个/ml;24小时连续光照条件下产毒能力显著高于其他2种处理，亚麻胚根生长抑制率达到64.3%，结果见表5。

表5 光照条件对亚麻枯萎病病菌生长和产毒的影响Tab.5 Effect of light treatment on F.oxysporum growth and toxin production

3 结论与讨论

3.1 亚麻枯萎病病原菌最适生长培养条件

MS无机盐+蔗糖培养液最适合病菌菌丝的生长，Armstrong镰刀菌培养液最适合病菌孢子的生长，病菌最适生长的温度为25℃，最适培养时间为25～30天，最适PH值为7，最适24小时连续黑暗下生长。

3.2 亚麻枯萎病病菌最适产毒培养条件

Richard培养液最适病菌产毒，病菌产毒最适的温度为30℃，最适培养时间为25天，最适PH值为7，最适24小时连续光照生长。

3.3 讨论

从研究结果来看在同一培养条件下随着菌丝生长，菌株产毒能力增强，但孢子浓度的多少与菌株产毒能力无必然联系，当孢子浓度升高到一定程度时，菌株产毒能力反而下降，这可能是孢子与毒素间竞争营养成分造成的，这与马国斌 (1996)[8]的研究结果一致。

本文仅对亚麻枯萎病病菌生长和产毒条件进行了研究，明确亚麻枯萎病病菌生长和产毒的最适培养条件，在今后的工作中还需对亚麻枯萎病病菌产生镰刀菌酸的规律进行继续研究探索，为亚麻枯萎病的高效防治和利用亚麻枯萎病粗毒素筛选亚麻枯萎病抗病品种奠定基础。

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