花生壳总黄酮提取工艺优化及其抑菌活性研究

毕海丹 万照东 崔旭海 李双双

摘要：采用醇提法探索花生壳中总黄酮的最佳提取工艺，并研究其抑菌活性。结果表明：花生壳总黄酮的最佳提取工艺为乙醇溶液浓度80%、提取温度80 ℃、提取时间3.0 h、料液比1 g ∶20 mL，各因素对总黄酮得率的影响由大到小依次为提取温度、乙醇溶液浓度、料液比、提取時间；验证试验表明，最佳提取工艺下花生壳总黄酮得率为0618%；抑菌试验表明，花生壳总黄酮对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌具有一定抑菌作用，且其抑菌效果远优于山梨酸钾。

关键词：花生壳；总黄酮；提取；抑菌活性；正交试验

中图分类号： TS201.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0297-03

中国是花生生产大国，花生种植广泛分布于全国各地，花生产量居世界第1位。花生壳是花生脱壳加工而产生的农副产品，其质量约占花生荚果总质量的30%左右。我国花生年产量约1 460万t，其中花生壳质量就高达450万t[1]。有研究将花生壳热压成型制作塑木板，或加工成饲料、燃料等，但大部分花生壳被作为废弃物扔掉，不但会破坏环境，而且造成了极大的资源浪费。黄酮类化合物具有清除体内自由基及毒素、预防心血管疾病以及抗过敏、抗肿瘤、广谱抗菌、抗病毒等作用[2-7]。本研究选用花生壳作为原料优化黄酮类化合物的提取工艺，并进行了抑菌试验，以期为降低黄酮类产品生产成本、拓展花生综合利用领域奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

将花生壳清洗烘干，冷却至室温，粉碎至通过孔径0.3 mm的网筛后，脱脂，备用。芸香苷标准品（纯度99%）购于成都生物科技有限公司；大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）由枣庄学院生物学实验教学中心微生物实验室提供；培养基为琼脂营养培养基。

1.1.2 仪器

AL104型电子天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司）；FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；JJ-1型精密增力电动搅拌器（江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂）；R2018-Ⅱ型旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；DK-S26型数显恒温水浴锅（上海三发科学仪器有限公司）；SHB-ⅢA型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；BM2000型生物显微镜（南京江南永新光学有限公司）；PLY-45型恒温培养箱（天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司）；SW-CJ-2FD型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；BXM-30R型高压蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 芸香苷标准曲线的制作

称取芸香苷标准品0.01 g，用70%乙醇溶液溶解，定容至50 mL容量瓶中，得到0.2 g/L芸香苷标准溶液。分别吸取芸香苷标准溶液0、1、2、3、4、5 mL于 10 mL 容量瓶中，先加70%乙醇溶液至5 mL左右，然后加入5%NaNO2 溶液0.3 mL，摇匀放置6 min后加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀放置6 min后加入1 mol/L NaOH溶液2 mL，混匀；用70%乙醇溶液定容至刻度线，摇匀，放置20 min。用1 cm比色皿于510 nm波长处测定吸光度。绘制标准曲线，得回归方程为y=15.343x-0.020 5（r2=0.998 7）。

1.2.2 花生壳总黄酮的提取

称取花生壳粉5 g，提取温度分别设置为50、60、70、80、90 ℃，回流提取时间分别为1、2、3、4、5 h，料液比分别为1 g ∶10 mL、1 g ∶15 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶25 mL、1 g ∶30 mL，分别以梯度浓度50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液作为提取溶剂提取总黄酮，采用硝酸铝比色法测定总黄酮吸光度。

1.2.3 总黄酮得率的计算 花生壳黄酮得率=花生壳黄酮含量/花生壳粉质量×100%。

1.2.4 花生壳总黄酮的抑菌试验

用纸片扩散法测定花生壳总黄酮的抑菌作用[8-9]。将灭过菌的直径5 mm的滤纸片放入不同浓度花生壳总黄酮溶液中浸泡1 h，备用。吸取浓度为5×107个/mL的菌悬液0.2 mL，用涂布法接种在培养基上，将滤纸片放入该含菌培养皿中，置于恒温生化培养箱中，于 37 ℃ 恒温培养1 d，测量抑菌圈直径。每个样品3次重复，空白对照为无菌蒸馏水。

1.2.5 花生壳总黄酮和山梨酸钾的抑菌活性比较

采用固体平板培养基稀释法测定抑菌活性[10]。取无菌试管10支，向后9支试管分别加入1mL无菌蒸馏水，取花生壳总黄酮提取液1 mL 移入1号试管，混匀后取出1 mL混合液转入2号试管，依次操作，至9号试管取出1 mL混合液弃去，将黄酮提取液分别稀释1、2、4、8、16、32、64、128、256倍。1～9号试管中均含有1 mL不同稀释度的提取液，10号试管为空白对照。在每支试管中加入9 mL熔化至55 ℃的固体琼脂培养基，充分混匀，倾注入平板，平板凝固后，接0.1 mL的菌液于37 ℃培养1 d。以培养基中完全没有菌生长时的最低浓度为最低抑菌浓度（MIC），根据MIC 初步确定抑菌浓度范围。山梨酸钾对供试菌的MIC测定方法同上。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 乙醇溶液浓度对总黄酮得率的影响

由图1可知，当乙醇溶液浓度为50%～70%时，总黄酮得率随着乙醇溶液浓度增大而提高；当乙醇溶液浓度为70%～90%时，总黄酮得率随着乙醇溶液浓度增大而逐渐降低。由此可见，提取花生壳总黄酮的最优乙醇溶液浓度为70%。

2.1.2 提取时间对总黄酮得率的影响

由图2可知，总体上看，随着提取时间延长，花生壳总黄酮得率不断提高。提取时间2.0 h下的总黄酮得率明显比提取时间1 h下的总黄酮得率高；提取时间从2.0 h延长到3.0 h时，总黄酮得率提高相对缓慢；提取时间为3.0～5.0 h时，随着提取时间延长，总黄

酮得率提高不明显。考虑到工业化生产时应节约时间、能源等问题，提取花生壳总黄酮的适合时间为3.0 h。

2.1.3 提取温度对总黄酮得率的影响

图3表明，提取温度为50～60 ℃时，随着提取温度升高，总黄酮得率明显提高；提取温度为60～80 ℃时，随着提取温度升高，总黄酮得率提高相对缓慢；提取温度为80～90 ℃时，随着提取温度升高，总黄酮得率却呈下降趋势。说明提取花生壳总黄酮的最优温度为70 ℃。

2.1.4 料液比对总黄酮得率的影响

图4表明，当料液比由1 g ∶10 mL变化至1 g ∶20 mL時，总黄酮得率也随之不断增大；当料液比由1 g ∶20 mL变化至1 g ∶30 mL时，总黄酮得率反而下降。说明提取花生壳总黄酮的最佳料液比为 1 g ∶20 mL。

2.2 正交试验结果与分析

花生壳总黄酮提取工艺正交试验方案与结果分别见表1、表2。由表2可见，RA>RB>RD>RC，因此在一定范围内，4个因素对试验结果的影响是不同的，提取温度对试验结果影响最大，其次是乙醇溶液浓度、料液比，最后是提取时间。花生壳提取总黄酮的最优工艺条件为A3B3C2D2，即提取温度80 ℃、乙醇溶液浓度80%、提取时间 3.0 h、料液比1 g ∶20 mL。在该条件下做验证试验，测得花生壳中总黄酮得率为0.618%。

2.3 抑菌试验结果与分析

由表3可知，花生壳总黄酮浓度与其抑菌效果呈正相关，表明花生壳总黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均有明显的抑制作用。当花生壳总黄酮浓度为2.0 g/L时，上述3种菌的抑菌圈直径均大于7.0 mm，花生壳总黄酮尤其对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑制效果明显，其抑菌圈直径分别为7.6、8.2 mm。当花生壳总黄酮浓度为 0.5 g/L 时，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌圈直径差异不明显，这可能与花生壳总黄酮浓度过低，对这2种菌的破坏能力差异不明显有关。

2.4 花生壳总黄酮和山梨酸钾的抑菌活性比较

花生壳总黄酮浓缩原液中黄酮含量为15.45 g/L，山梨酸

3 结论

本研究表明，提取花生壳总黄酮的最佳工艺条件为提取温度80 ℃、乙醇溶液浓度80%、提取时间3.0 h、料液比 1 g ∶20 mL。各因素对总黄酮得率的影响由大到小依次为提取温度、乙醇溶液浓度、料液比、提取时间。验证试验表明，最佳工艺条件下花生壳总黄酮得率为0.618%。抑菌试验表明，花生壳总黄酮对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均有抑菌作用，且其抑菌效果远高于山梨酸钾，具有作为食品抑菌剂的良好开发前景。

参考文献：

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