利用AFLP构建棉花遗传图谱及纤维品质性状QTL分析

王志伟 魏利民 谢晓美 吴立强 +张贵寅

摘要：利用AFLP分子标记技术，以陆地棉（Gossypium hirsutum L.）品种中棉所8号与海岛棉（Gossypium barbadense L.）品种Pima90杂交产生的F2群体为材料，构建了包含11个连锁群和86个标记位点（31个标记位点前人未曾报道）的连锁图谱，图谱总长562.4 cM，约占棉花基因组的12.5%，标记间平均距离为6.5 cM。该图谱有5个连锁群被定位到相应的染色体上，6个连锁群未定位于染色体上。应用复合区间作图法分析F2单株和F2 ∶3家系的纤维品质性状，检测到11个与纤维品质有关的QTL，包括5个纤维长度（FL）、3个整齐度（FU）、1个马克隆值（FM）、2个伸长率（FE）的QTL，分别解释表型变异的17.7%～38.3%、16.3%～24.2%、24.7%、22.2%～46.5%。

关键词：棉花；AFLP；遗传图谱；纤维品质；QTL

中图分类号： S562.03 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0071-03

棉花是重要的天然纤维作物，棉花产业在国民经济中占有重要的战略地位。随着社会进步和纺织技术的发展，对棉花纤维品质要求也在逐步提高。棉花纤维品质是数量性状，纤维品质和产量性状之间存在负相关，以传统的育种方法同步改良产量和品质难度很大[1]。利用分子标记技术构建高密度的分子遗传图谱，定位控制数量性状的基因，进行标记辅助选择育种，可显著提高育种效率。目前，在棉花中利用分子标记技术已经构建了多张遗传图谱[2-8]，在棉花产量及其构成因素、纤维品质、部分形态性状方面进行了QTL定位研究[9-14]；但是不同研究标记顺序、图距、QTL数量、位置和效应等方面都存在较大差异，不利于遗传图谱和QTL的整合[4]。本研究以海岛棉与陆地棉杂交F2群体为材料，利用AFLP分子标记技术，进行遗传图谱构建，并对纤维品质性状进行了QTL分析，为分子标记辅助选择育种提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以中棉所8号和海岛棉Pima90为亲本配制杂交组合，2008年在河北保定种植F1代并自交，2009年种植F2获得145个单株，将F2单株自交获得F2 ∶3家系，2010—2011年，在河北保定、青县2地分别种植F2 ∶3家系。亲本、F1、F2单株及F2 ∶3家系的纤维样品，包括纤维长度、整齐度、马克隆值、伸长率送农业部棉花品质监督检验测试中心测定。

1.2 棉花基因组DNA提取及引物筛选

棉花总DNA提取参考Zhang等改进的CTAB方法[15]。AFLP标记所用的EcoRⅠ+3和MseⅠ+3的引物各10个，分别为E32（AAC）、E33（AAG）、E35（ACA）、E36（ACC）、E37（ACG）、E38（ACT）、E40（AGC）、E41（AGG）、E57（CGG）、E71（GGA）和M47（CAA）、M48（CAC）、M49（CAG）、M50（CAT）、M59（CTA）、M60（CTC）、M61（CTG）、M62（CTT）、M71（GGA）、M82（TAT），随机组配成100对不同的引物。参考Marnik等的反应体系和扩增程序[16]，用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法检测扩增产物。由上海生工生物工程有限公司合成所有引物。

1.3 遗传图谱的构建及纤维品质性状的QTL分析

利用Mapmarker/EXP（Version 3.0）进行标记连锁分析，LOD最小值取3.0，最大遗传距离为50 cM，采用Kosambi函数构建遗传连锁图谱。运用Windows QTL Cartographer 2.5软件的复合区间作图法[17]，检测QTL的最低LOD值为2.5。QTL作用方式按Stuber等的标准[18]判定。利用绘图软件MapChart2.1绘制连锁图谱与QTL分布图。

2 结果与分析

2.1 亲本及纤维品质性状分析

对亲本和F2 ∶3家系纤维品质性状数据进行统计分析（表1），中棉所8号的马克隆值与伸长率明显高于海岛棉 Pima90，而纤维长度低于Pima90，双亲纤维品质的差异为构建遗传图谱和QTL定位奠定了基础。4个纤维品质性状在F2 ∶3家系群体中均呈连续分布，表明这些性状属于多基因控制的数量性状。偏度和峰度的计算结果表明分离群体纤维品质相关性状数据偏斜度绝对值均小于1，符合正态分布。纤维长度、马克隆值和伸长率变异系数都在10%左右，说明这3个性状在F2 ∶3家系间具有广泛的遗传变异。

2.2 AFLP引物的筛选及群体检测

用双亲和F1的DNA对随机组配的100对AFLP引物进行多态性筛选，共筛选出在亲本中存在明显多态性的引物20对，占筛选引物总数的20%，用这20对引物对F2群体进行检测，共得到132个多态性标记。卡方测验显示，132个标记位点中有36个偏离孟德尔分离比例，占总标记的27.3%，定位到图谱上12个。

2.3 连锁图谱的构建

对132个标记位点进行连锁分析，构建的遗传连锁图谱包括86个标记和11个连锁群，最长的为135.4 cM，最短的为21.6 cM，标记间平均距离为6.5 cM，图谱总长562.4 cM，约占棉花基因组的12.5%。通过对已构建的遗传连锁图谱进行比对[2，7，9，13]，11个连锁群中有5个连锁群定位到了染色体上，分别是Chr.4、Chr.9、Chr.12、Chr.14、Chr.25，其余6个连锁群没有定位到染色体或亚组上，暂定为LG1～LG6（图1）。

2.4 纤维品质性状的QTL分析

通过复合区间作图方法对棉花纤维品质性状进行QTL定位分析，共定位11个与纤维品质性状有关的QTL（表2），分布在Chr.4、Chr.9、Chr.12、Chr.25和LG1上。其中控制纤维长度的QTL有5个，位于Chr.9、Chr.12和Chr.25上，可解释表型变异的17.7%～38.3%；控制整齐度的QTL有3个，位于Chr.12上，可解释表型变异的16.3%～24.2%；只检测到1个与马克隆值相关的QTL，位于Chr.4上，可解释表型变异的24.7%；检测到2个与伸长率相关的QTL，位于Chr.9 和LG1上，可解释表型变异的22.2%～46.5%。其中Chr.12上存在着2个纤维长度和整齐度的QTL重叠区间。

从|D|/|A|比值可知，5个纤维长度的QTL中，qFL1、qFL2、qFL3和qFL4均表现超显性效应，qFL5表现为显性效应；3个整齐度的QTL中，qFU1表现为显性效应，qFU2和qFU3表现超显性效应；马克隆值的1个QTL表现超显性效应；伸长率的2个QTLs，qFE1和qFE2均表现部分显性效应。

3 讨论

近年来，国内外报道的遗传图谱中，利用海陆棉花杂交群体，Lacape等以RFLP-SSR-AFLP构建了包含888个标记位点的图谱[2]；Nguyen等以RFLP-SSR-AFLP构建了包含1 160个标记位点的图谱[3]；Wang等利用陆陆杂交群体，以RAPD-SSR-AFLP-SRAP构建了包含132个标记位点的图谱[5]。这些图谱几乎覆盖异源四倍体棉花的全部基因组， 但是图谱上空隙较多，利用AFLP标记较少，AFLP标记具有丰富的多态性，在基因组上均匀分布，可以充分填补图谱上的空隙。通过与已有图谱以及本实验室已有结果进行比较[2-3，5，10，13]，本研究所构建的包含86个AFLP标记、11个连锁群的遗传图谱，其中有31个标记前人未曾报道，为进一步填补图谱空隙、构建饱和的高密度棉花图谱奠定了基础。

目前，在许多研究中发现控制棉花纤维品质性状和产量性状的QTL有成簇分布在染色体（连锁群）上的现象。张培通等在LGD08染色体上检测出了9个控制产量的QTL[1]；Wang等在A01、D2和D6染色体上检测出成簇分布的棉花产量和纤维品质性状的QTL[5]；He等在海陆杂交群体中发现，棉花重要经济性状成簇分布在A3、A8和D9染色体上[11]。本研究发现在Chr.12上qFL2和qFU2存在着重叠区间，qFL3和qFU3存在着重叠区间。这种现象表明，控制不同纤维品质性状的基因可能紧密连锁或一因多效，QTL可能会发挥其多重功能，一定程度上解释了纤维品质性状间的表型相关，但是这种现象是基因连锁还是一因多效还有待进一步研究。

本研究检测出的关于纤维品质性状的QTLs中，有9个表现显性和超显性效应，显性基因作用或者显性与显性基因的相互作用，对陆地棉和海岛棉间进行渐渗杂交，有效转移海岛棉纤维品质优良基因提高陆地棉纤维品质能够起到一定的作用。

参考文献：

[1]张培通，郭旺珍，朱协飞，等. 高产棉花品种泗棉3号产量及其构成因素的QTL标记和定位[J]. 作物学报，2006，32（8）：1197-1203.

[2]Lacape J M，Nguyen T B，Thibivillier，et al. A combined RFLP-SSR-AFLP map of tetr aploid cotton based on a Gossypium hirsutum×Gossypium barbadense backcross population[J]. Genome，2003，46：612-626.

[3]Nguyen T B，Giband M，Brottier P，et al. Wide coverage of the tetraploid cotton genome using newly developed microsatellite markers[J]. Theoretical and Applied Genetics，2004，109（1）：167-175.

[4]Song X L，Wang K，Guo W Z，et al. A comparison of genetic maps constructed from haploid and BC1 mapping populations from the same crossing between Gossypium hirsutum and Gossypium barbadense[J]. Genome，2005，48：375-389.

[5]Wang B H，Guo W Z，Zhu X F，et al. QTL mapping of fiber quality in an elite hybrid derived-RIL population of upland cotton[J]. Euphytica，2006，152：367-378.

[6]Guo W Z，Cai C P，Wang C B，et al. A microsatellite-based，gene-rich linkage map reveals genome structure，function and evolution in gossypium[J]. Genetics，2007，176（1）：527-541.

[7]Zhang Z S，Hu M C，Zhang J，et al. Construction of a comprehensive PCR-based marker linkage map and QTL mapping for fiber quality traits in upland cotton（Gossypium hirsutum L.）[J]. Molecular Breeding，2009，24（1）：49-61.

[8]Yu Y，Yuan D J，Liang S G，et al. Genome structure of cotton revealed by a genome-wide SSR genetic map constructed from a BC1 population between Gossypium hirsutum L. and Gossypium barbadense L.[J]. BMC Genomies，2011，12：15-23.

[9]Mei M，Syed N H，Gao W，et al. Genetic mapping and QTL analysis of fiber-related traits in cotton （Gossypium）[J]. Theoretical and Applied Genetics，2004，108（2）：280-291.

[10]Lacape J M，Nguyen T B，Courtois B，et al. QTL analysis of cotton fiber quality using multiple Gossypium hirsutum×Gossypium barbadense backcross generations[J]. Crop Science，2005，45：123-140.

[11]He D H，Lin Z X，Zhang X L，et al. QTL mapping for economic traits based on a dense genetic map of cotton with PCR-based markers using the interspecific cross of Gossypium hirsutum L.×Gossypium barbadense L.[J]. Euphytica，2007，153：181-197.

[12]Qin H D，Guo W Z，Zhang Y M，et al. QTL mapping of yield and fiber traits based on a four-way cross population in Gossypium hirsutum L.[J]. Theoretical and Applied Genetics，2008，117：883-894.

[13]杨鑫雷，王志伟，张桂寅，等. 棉花分子遗传图谱构建和纤维品质性状QTL分析[J]. 作物学报，2009，35（12）：2159-2166.

[14]Liu R Z，Wang B H，Guo W Z，et al. Quantitative trait loci mapping for yield and its components by using two immortalized populations of a heterotic hybrid in Gossypium hirsutum L.[J]. Mol Breeding，2012，29：297-311.

[15]Zhang Z S，Xiao Y H，Luo M，et al. Congstruction of a genetic linkage map and QTL analysis of fiber-related traits in upland cotton（Gossypium hirsutum L.）[J]. Euphytica，2005，144：91-99.

[16]Vuylsteke M，Peleman J D，van Eijk M J T.AFLP technology for DNA fingerprinting[J]. Nature Protocols，2007，2：1387-1398.

[17]Wang S C，Basten C J，Zeng Z B. Windows QTL cartographer 2.5 user manual[D]. Raleigh，USA：North Carolina State University，2005.

[18]Stuber C W，Edwardsm D，Wendel J F. Molecular marker facilitated investigations of quantitative trait loci in maize Ⅱ. Factors influencing yield and its component traits[J]. Crop Science，1987，27：639-648.