用统计学方法优化硝苯地平脂质体处方

杨雪薇,杨 爽,董冰雪,郭鲁强,刘 晖,滕乐生

(1.吉林大学 生命科学学院,长春 130012;2.吉林大学第四医院 药学部,长春 130011)



用统计学方法优化硝苯地平脂质体处方

杨雪薇1,杨 爽1,董冰雪1,郭鲁强1,刘 晖2,滕乐生1

(1.吉林大学 生命科学学院,长春 130012;2.吉林大学第四医院 药学部,长春 130011)

采用乙醚注入法制备硝苯地平脂质体,在单因素实验基础上用Box-Behnken设计实验,并用统计学方法考察磷脂量、脂药比和胆固醇磷脂比对脂质体包封率的影响.结果表明:多元二次回归模型最优处方制备的硝苯地平脂质体平均包封率为86.54%;人工神经网络模型结合遗传算法最优处方制备的硝苯地平脂质体平均包封率为97.25%;与二次回归模型相比,人工神经网络模型更适于优化硝苯地平脂质体的制备.优化后得到最佳制备处方为：磷脂量612.4 mg,脂药比为60.02,磷脂胆固醇比为6.401.

硝苯地平；脂质体；乙醚注入法；Box-Behnken；人工神经网络

硝苯地平(nifedipine)是钙离子拮抗剂类药物的典型代表,为黄色结晶粉末或针状晶体,在临床上用于心绞痛、高血压及心衰的治疗[1-2].但硝苯地平存在水中溶解度小、制剂生物利用度低、对光敏感、遇光分解产物有毒和稳定性差等缺点.研究表明,脂质体制剂可显著提高药物的治疗指数,减少给药次数,从而降低药物的不良反应,是一种高效低毒的新型给药系统[3-4].由于脂质体处方的设计较复杂,因此采用单因素设计等常规方法不易得到最优结果.人工神经网络(ANN)是基于生物神经网络的非线性计算模型,通过网络结构相互关联节点的数学模型模拟人脑学习过程[5].在神经网络建立后,其内存空间被遗传算法(GA)充分利用,GA是非线性的最优化形式[6].本文采用统计学方法优化硝苯地平脂质体的处方,应用Box-Behnken设计实验,利用多元二次回归模型[7-8]和ANN模型结合GA对硝苯地平脂质体处方进行筛选.

1 材料与方法

1.1仪器与试药

LC-10AVP型高压液相色谱仪(日本岛津公司)；BS224S型电子天平(德国赛多利斯公司)；PhD D3-L型高压均质机(美国Phdtech公司)；5810R型冷冻离心机(德国Eppendorf公司).硝苯地平(陕西惠诚生物科技有限公司)；硝苯地平标准品(中国药品生物制品检定所)；蛋黄卵磷脂(广州汉方有限公司)；胆固醇(上海惠世生化试剂有限公司)；甲醇和乙腈为色谱纯;无水乙醚等其他试剂为分析纯.

1.2方法

1.2.1 乙醚注入法制备硝苯地平脂质体 取适量卵磷脂、胆固醇和硝苯地平,加入一定量乙醚搅拌,溶解.将乙醚溶液用注射器快速注入已恒温至30 ℃的45 mL去离子水中,30 ℃搅拌2 h,使乙醚挥发尽,制成脂质体.用高压均质法进行整粒,均质压力为55 MPa,共均质8次[9].

1.2.2 硝苯地平质量浓度测定 HPLC条件：色谱柱为460 mm×150 mm的C18柱,检测波长为205 nm,流速1.0 mL/min,柱温30 ℃.流动相为V(乙腈)∶V(水)=1,进样量20 μL[10].先将10 mg硝苯地平标准品配置成200 μg/mL的硝苯地平乙醇母液,再用逐级稀释的方法配置各溶液,用0.22 μm有机滤膜过滤后,依次进样.

1.2.3 包封率测定 取制备的硝苯地平脂质体100 μL,甲醇破乳,过0.22 μm滤膜后注入高效液相色谱仪测定.取5 mL硝苯地平脂质体于8 000 r/min离心30 min后,取上清液100 μL,甲醇破乳,过0.22 μm滤膜后注入高效液相色谱仪测定,计算包封率.

1.2.4 单因素试验优化脂质体制备处方

1)磷脂量的考察：称取硝苯地平10 mg,胆固醇100 mg,分别称取蛋黄卵磷脂200,300,400,500,600,700 mg,按1.2.1方法进行操作,得到脂质体.

2)脂药比的考察：称取蛋黄卵磷脂600 mg,胆固醇100 mg,分别称取m(蛋黄卵磷脂)∶m(原料药)=20,40,60,80,100,120,按1.2.1方法进行操作,得到脂质体.

3)胆固醇磷脂比的考察：称取蛋黄卵磷脂600 mg,硝苯地平7.5 mg,胆固醇适量,分别使m(胆固醇)∶m(蛋黄卵磷脂)=0,1∶24,1∶12,1∶8,1∶6,1∶4,按1.2.1方法操作,得到脂质体.

1.2.5 Box-Behnken效应面优化处方设计 在单因素基础上,进行3因素3水平的中心组合设计实验,按表1的因素水平表进行15组实验,测定脂质体包封率,以包封率为指标进行优化.实验结果采用多元二次回归模型分析.

表1 Box-Behnken因素水平表Table 1 Variables in Box-Behnken design

1.2.6 人工神经网络模型优化处方 从Box-Behnken设计试验中随机抽取一组数据作为预测集和测试集,其他数据作为校正集.3层反馈给人工神经网络模型,由于一些隐藏节点对人工神经网络模型影响较大,因此采用接近标准程度(Da)选择合适的隐藏节点：

(1)

其中:MSEc和MSEt为校准设置和验证设置的均方误差(MSE);nc和nt为校准设置和验证设置的数量;n为校准设置和验证设置的总数;c为调整较好Da的一个连续数字(本文c=1 000).所得结果用MATLAB7.6.0.324(R2008a,美国MathWorks公司)软件分析.

人工神经网络模型确立后,用GA在测试区域内搜寻最优值.GA参数为：群体类型为双重向量,群体容量为20,初始群体随机给出,作为随机统一的选择功能,精确算法为2,交叉率为0.8,交叉作用是离散的,迁移率为0.2,罚因子为100,用GA得到的世代数目为100.拟合度定义为

(2)

其中NTANN model为通过神经网络模型计算得到的NT值.

1.2.7 验证试验 为检验多元二次回归模型和人工神经网络模型预测处方的准确性与可行性,分别用各自得到的最佳处方配比制备硝苯地平脂质体,进行3次平行验证试验.

2 结果与讨论

2.1硝苯地平标准曲线的绘制以色谱峰面积为纵坐标,标准溶液质量浓度为横坐标绘制标准曲线,得回归方程y=77 476.023 98x-21 820.591 56,R2=0.999 73,表明硝苯地平在5～40 μg/mL内线性关系良好.

2.2单因素试验结果

因素X1,X2,X3对硝苯地平脂质体包封率的影响如图1所示.由图1可见,X1,X2,X3的最佳值分别为600 mg,80,1∶6.因此确定以最佳条件为中心组合实验的中心点进行优化.

图1 X1(A),X2(B)和X3(C)对包封率的影响Fig.1 Effects of X1(A),X2(B)and X3(C)on the encapsulation efficiency of liposome

2.3Box-Behnken中心组合实验优化处方设计结果

中心组合实验结果列于表2,多元二次回归分析结果列于表3.

表2 Box-Behnken中心组合设计方案及试验结果Table 2 Matrix of Box-Behnken design and the corresponding experimental results

拟合得到回归方程为

(3)

该模型P=0.003 021,相关系数R2=96.85%,表明96.85%的实验数据均符合该模型拟合,即该方程的拟合充分,回归方程高度显著,模型准确可行.

表3 多元二次回归分析结果Table 3 Statistical results of multivariate quadratic regression analysis

回归分析结果的响应曲面如图2所示.由图2可见,在检测范围内,3个响应曲面均为开口向下的凸形曲面,表明响应值(提取率)存在极高值,其等高线中心均位于-1～1,表明提取的最优条件存在于所设计的因素水平范围内.图2(C)中的等高线呈椭圆形,且坐标轴与椭圆形轴线间存在较大的夹角,表明X1和X3间存在显著的交互作用.计算得到最优提取条件的编码值为：X1=-0.038 66,X2=-0.600 75,X3=-0.052 58,代入变换公式可得Z1=596.134 mg,Z2=67.985,Z3=5.947,即最佳处方为：磷脂质量596.134 mg,m(脂)∶m(药)=67.985,m(胆固醇)∶m(磷脂)=1∶5.947,由回归方程可得包封率的预测值为93.065%.

图2 响应面和等高线图Fig.2 Responsive surfaces and contours

2.4人工神经网络模型结果

人工神经网络模型结果如图3所示.由图3可见,第11个节点Da值最大.当隐藏的节点数设定为11时,优化后神经网络模型的决定系数R2=0.951 6,表明人工神经网络模型可靠.世代数对拟合度的影响如图4所示.由图4可见:当世代数为31时,拟合度最低；世代数继续增长时,拟合度基本保持不变.通过GA获得优化后培养条件的编码值为：U1=0.124,U2=-0.999,U3=0.401; 对应的实验值为：W1=612.4 mg,W2=60.02,W3=6.401.在优化后处方条件下的预期包封率为98.457 8%.

图3 隐藏层节点数对Da的影响Fig.3 Effect of the number of hidden nodes on Da

图4 世代数对拟合度的影响Fig.4 Effect of the number of generations on fitness

2.5验证试验结果

多元二次回归模型最优处方制备的硝苯地平脂质体平均包封率为86.54%,与预测值的相对误差为4.62%;人工神经网络模型最优处方制备的硝苯地平脂质体平均包封率为97.25%,与预测值的相对误差为0.86%.两组验证试验结果表明,人工神经网络模型更适于制备硝苯地平脂质体.

综上所述,本文采用乙醚注入法制备硝苯地平脂质体,高压均质法进行整粒,在单因素实验基础上,采用Box-Behnken设计实验,通过多元二次回归模型和人工神经网络模型结合GA算法,考察了m(磷脂)、m(脂)∶m(药)、m(胆固醇)∶m(磷脂)对脂质体包封率的影响.结果表明,与多元二次回归模型相比,人工神经网络模型更适于制备硝苯地平脂质体,优化后最优处方为m(磷脂)=612.4 mg,m(脂)∶m(药)=60.02,m(胆固醇)∶m(磷脂)=1∶6.401,其包封率为97.25%.

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(责任编辑：单 凝)

OptimizethePreparationFormulationofNifedipineLiposomebyStatisticalMethods

YANG Xuewei1,YANG Shuang1,DONG Bingxue1,GUO Luqiang1,LIU Hui2,TENG Lesheng1

(1.CollegeofLifeScience,JilinUniversity,Changchun130012,China；2.DepartmentofPharmacy,TheFourthHospitalofJilinUniversity,Changchun130011,China)

The nifedipine liposome was prepared from an appropriate amount of lecithine,cholesterol and nifedipine by the ether injection method.On the basis of single factor experiment,we used statistical methods to investigate the effects of phospholipid amount,lipid drug ratio,cholesterol phospholipid ratio on the encapsulation efficiency of liposome.The results show that the encapsulation rate of the liposome prepared based on multivariate quadratic regression model was 86.54%,and the encapsulation rate of the liposome prepared based on artificial neural network model was 97.25%.Compared with the quadratic regression model,artificial neural network model combined with genetic algorithm is more suitable for optimizing the preparation technique of nifedipine liposome.After optimizing,the best preparation formulation is 612.4 mg of phospholipid with a lipid drug ratio of 60.02 and a cholesterol phospholipid ratio of 6.401.

nifedipine;liposome;ether injection method;Box-Behnken;artificial neural network

10.13413/j.cnki.jdxblxb.2015.03.41

2014-07-14.

杨雪薇(1990—),女,汉族,硕士研究生,从事生物制药技术的研究,E-mail:yangxw1309@163.com.通信作者：滕乐生(1983—),男,汉族,博士,副教授,从事生物制药技术的研究,E-mail:tenglesheng@jlu.edu.cn.

R944

：A

：1671-5489(2015)03-0572-05