猪传染性胃肠炎病毒结构蛋白及疫苗的研究进展

谢 伟 ，程 洋 ，张 勇 ，文水英 ，张德勇 ，马永梅

（1.四川省乐山市沙湾区动物疫病预防控制中心，四川 乐山 614900；2.四川省乐山市沙湾区谭坝乡畜牧兽医站，四川 乐山 614903；3.四川省乐山市沙湾区嘉农镇畜牧兽医站，四川 乐山 614902）

猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）属于冠状病毒科，是引起仔猪肠道疾病的重要病原之一，以急性腹泻、呕吐、脱水为临床症状，可致2周龄内的仔猪100%死亡[1]。目前该病无特效治疗药物，接种有效的猪传染性胃肠炎疫苗是预防本病的主要手段。

1 TGEV结构蛋白

TGEV为有囊膜病毒，基因组为单股正链具有感染性的RNA，全长约28.5kb，分子量为6×103ku[2]。TGEV全基因组分为7个区，每个区包含1个或多个开放阅读框（ORF），整个基因组结构顺序为5′1a-1b-S-3a-3b-sM-M-N-3′，其中基因 S、sM、M、N 编码TGEV的四种结构蛋白，即纤突蛋白（S）、核蛋白（N）、膜结合蛋白（M）和小膜蛋白（sM），这4种结构蛋白及其在病毒粒子中的功能各有特点。

1.1 S蛋白 纤突蛋白（S）为糖蛋白，具有花瓣状囊膜突起，突出于病毒粒子表面。编码S蛋白的S基因全长约4350bp，最初合成的S蛋白前体由1447或1449个氨基酸残基组成，经切除信号肽和终末糖基化而成熟，分子量约195～220ku，是TGEV结构蛋白中最大的蛋白。S蛋白携带的B淋巴细胞抗原决定簇是诱导机体产生中和抗体和提供免疫保护的主要结构蛋白，在TGEV免疫保护方面发挥主导作用[3]。

1.2 N蛋白 N蛋白是一种磷酸化的酸性蛋白，并以螺旋式结构围绕RNA存在于病毒粒子内部，是病毒核衣壳形成螺旋形结构的基础。编码N蛋白的N基因长约1700bp，分子质量约为45kD，编码382个氨基酸，氨基酸残基缠绕在一起，缠绕程度与丝氨酸的专一磷酸化有关[4]。N蛋白具有A、B、C三个高度保守的抗原区域，在诱导产生细胞免疫应答中起着重要作用[5]。

1.3 M蛋白 M蛋白是一种膜蛋白，在冠状病毒中含量最多，是病毒粒子装配的必需成分。编码M蛋白的M基因全长约2600bp，编码262个氨基酸残基的M蛋白前体，切掉其N末端17个氨基酸残基信号肽而成熟，分子质量约为29～31ku，连接1条富含甘露糖天冬酰胺的侧链。M蛋白的6～22氨基酸残基区有一干扰素基因决定簇，可以帮助TGEV诱导产生干扰素，TGEV感染的仔猪血液和肠道中可检测出高水平的IFN-α[6]。用M蛋白制备的特异性单克隆抗体能有效地阻断IFN-α干扰素的合成，而S、N蛋白的特异性单克隆抗体无此作用，提示在宿主抵抗病毒感染过程中M蛋白发挥了重要作用。

1.4 sM蛋白 sM结构蛋白是一种较小的膜结合蛋白，抗原位点位于C末端。编码sM蛋白的基因全长约249 bp，编码82个氨基酸，分子质量约78 ku，多肽扫描技术发现64-AYKNF-68残基是诱导产生抗sM单克隆抗体的核心序列。Baudou等[7]研究发现，TGEV M蛋白和sM蛋白共表达是病毒样颗粒组装和释放的必要条件，而且M蛋白与sM蛋白形成的VLPs能够诱导IFN-α产生，可抵御TGEV的感染。

2 疫苗研究

TGEV疫苗大致经历了4个阶段，即人工感染强毒、灭活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗。

2.1 人工感染强毒 人工感染强毒是将发病猪的内脏或排泄物（含有强毒）掺入饲料饲喂，感染全场成年猪，尤其是妊娠后期母猪，使之产生免疫力，通过初乳保护仔猪。该方法虽然使仔猪获得了一定的保护，但易造成场地等环境污染，且母猪抵抗力降低后易继发感染其他疫病，导致强毒持续存在，不利于对该病原的消灭和控制，该方法现已被疫苗取代。

2.2 灭活疫苗 TGEV灭活疫苗分为组织灭活苗和细胞灭活苗。曹军平等[8]采集急性发病且具有典型症状的病猪空肠（包括肠内容物）及肠系膜淋巴结，通过冻融、灭活、乳化制成组织灭活苗，经实验室和野外试验证实该苗安全可靠、保护率较高。贾华强[9]利用分离的TB株制成灭活细胞苗在4个流行TGE的猪场进行试验，结果显示免疫母猪所产仔猪在断乳时的死亡率平均是8.5%，表明TGE细胞灭活苗具有较好的保护率。灭活疫苗虽然具有一定的保护率，也可以解决场地污染问题，但其只能通过注射免疫，诱导免疫应答较慢，不能刺激母猪产生有效的乳汁免疫，且制苗成本也比较高昂。

2.3 弱毒疫苗 TGEV弱毒疫苗毒株主要有美国的TGE-Vac株、匈牙利的CKP株、日本的TO-163株以及我国的华泰株。华泰株是在原代胎猪肾细胞上经165次传代致弱，并经过5次克隆纯化筛选而得。弱毒苗不宜在肠黏膜上皮细胞上吸附增殖，对肠黏膜的刺激较弱，因此乳汁中主要是IgG抗体，分泌型IgA较少，这是长期认为弱毒疫苗免疫效果不理想的主要原因。弱毒疫苗的免疫原性虽然优于灭活疫苗，但存在潜伏感染、排毒散毒、毒力返祖等缺陷。

2.4 基因工程疫苗 传统疫苗虽然在预防TGE上有一定的效果，但在某种程度上存在不可避免的缺陷。随着对TGEV分子生物学研究的深入，TGEV基因工程疫苗的研究取得了较快发展。

2.4.1 亚单位疫苗 亚单位疫苗可分为生物合成亚单位疫苗和重组抗原表位亚单位疫苗。生物合成亚单位疫苗是把保护性抗原基因导入细胞或受体菌，将其高效表达产物加以适合的佐剂乳化而制成。秦志华等[10]将S基因上A、B、C、D四个位点进行RT-PCR扩增，构建重组质粒pET30a-S，将纯化的蛋白免疫小鼠可诱导产生特异性的体液免疫。用抗原表位氨基酸序列制备的疫苗称为重组抗原表位亚单位疫苗。亚单位疫苗安全性高、副作用小，但免疫原性没有全病毒的好，产生的中和抗体水平低。因此，开发出增强亚单位疫苗免疫原性的佐剂已成为研究热点。

2.4.2 核酸疫苗 又称基因疫苗，是将编码某种抗原蛋白的外源基因克隆到真核质粒表达载体上并导入动物体细胞内，通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答。任晓峰等[11]在国内外首次构建了含有TGEV S基因的主要抗原位点（A、C、D）的SaPCI和含有TGEV完整S基因的SPCI两种核酸疫苗，将这两种重组核酸疫苗免疫小鼠后发现两者都具有能激发机体产生保护性反应的免疫能力，但前者的免疫效果优于后者。宋振辉等[12]将TGEV的M和N结构蛋白基因分别克隆到FastBacTMDual载体，经转化DH10Bac感受态细胞和转染昆虫细胞sf9，获得重组杆状病毒rBac-M和rBac-N，通过口服免疫小鼠，结果显示该重组杆状病毒可诱导小鼠产生黏膜免疫和体液免疫应答。核酸疫苗具有易于制备、可塑性大、生产工艺简单和成本低等优点，并可以同时构建编码不同蛋白的重组质粒同时预防多种疫病。但核酸疫苗也有这样一些问题，如外源目的基因选择问题，载体和载体启动子对外源基因表达有影响等。

2.4.3 转基因植物疫苗 随着植物高效基因载体系统和遗传转化技术的发展，利用转基因植物生产动物基因工程疫苗用于防控动物疫病已成为当前研究的热点。Gomez等[13]将TGEV的S基因克隆到花椰菜花叶病毒（CaMV35S）启动子下游并转染到拟南芥的种子中，成功构建了TGEV转基因植物疫苗，用该植物饲喂生猪可产生中和抗体，具有免疫保护作用。Gomez等[14]将TGEV的S蛋白的N端结构域转入到马铃薯中制成转基因马铃薯，用其饲喂小鼠可产生抗S蛋白的特异性血清抗体。目前，TGEV的S基因已被转入马铃薯、烟草、红豆花叶、拟南芥、玉米等植物中，并进行了相关的动物实验，部分已检出相应抗体，表明TGEV转基因植物疫苗有广阔的发展前景。

3 结语

近年来，随着分子生物学和免疫学技术的不断发展，对TGEV基因组结构、结构蛋白和基因工程苗等方面的研究已取得了较大的进展，但对非结构蛋白的结构和功能、抗TGEV感染的保护性免疫机制、毒株间的变异对致病性的影响等还有待于深入研究。此外，由于疫苗生产技术等因素的影响，传统疫苗在市场上仍占有较大的比例，改进工艺、研究免疫原性好的菌（毒）株，尤其是基因工程疫苗，将是今后疫苗研究的一个重要方向。

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