超声波清洗中药黄芪应测项目和方法的探讨

李芳蓉，刘凤霞，刘淑梅，陈 军，张尚智

（甘肃中医学院定西校区，甘肃 定西743000）

甘肃省定西市陇西县是“中国黄芪之乡”。梁代医药学家陶弘景《本草经集注》云：“黄芪第一出陇西，色黄白，味甜美，今亦难得。”可见，黄芪为陇西地道珍贵药材，并以根条粗大、质坚而绵、粉性足、药用成份含量高而成为芪中精品，具有“补气升阳、益固表，利水消肿，托疮生肌”之功效，因质量稳定，疗效确切，用途不断拓展。黄芪是典型根类中草药，未处理前根部可能带有大量泥土、病原生物及虫卵等，贮藏、运销和深加工前需耗费大量人力和水进行洗涤、晾晒和硫磺熏蒸防蛀、防腐等，且净洗效果欠佳。采用超声波清洗则可能降低劳动强度、节水、彻底清洗泥土、抑制病原微生物与虫卵、防止药效成分散失等。但超声波清洗后有效成分散失与否、散失量高低需实验验证。超声波技术在药材有效成分提取中已经广泛应用，但在清洗中的定性和定量研究较少。本文针对定西市三大主栽根类中草药之一黄芪，探讨确定普通水洗和不同超声频率和强度的超声波清洗黄芪后，其有效成分散失与否及散失量的定性、定量分析检测项目和方法手段。

1 分析检测项目的确定

黄芪又名绵芪、绵黄芪，是一味重要的传统大宗药材，始载于《神农本草经》，列为上品，是当前中医临床处方和中成药中用量最大的中药之一，药界素有“十药八芪”之称，也是出口的大宗品种。《中国药典》2010 版一部规定，黄芪为豆科植物蒙古黄芪（Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hisao）或膜荚黄芪（Astraga-lus membranaceus（Fisch.）Bge.）的干燥根及根茎，黄芪味甘，性微温，归脾、肺经。具有补气升阳、益卫固表、生津养血，行滞通痹、托毒生肌和利水消肿等功效；临床用于脾肺气虚、食少便溏、中气下陷、久泻脱肛、便血崩漏、表虚自汗、痈疽难溃、气虚血滞、浮肿尿少、半身不遂和痹痛麻木、慢性肾炎、蛋白尿及糖尿病等。药理作用为提高免疫功能、增强抗氧化、抗辐射、抗骨质疏松、抗突变、抗癌作用，保护心脑血管、肝、肾和肺，保护脑细胞、提高记忆力，舒张血管平滑肌，抗心律失常、清除自由基、抗细胞凋亡、抗衰老、抗菌抑病毒作用，降血脂、降血糖、双向调节血压、减少糖尿病并发症等。临床上广泛用于治疗循环系统、神经系统、消化系统、呼吸系统、内分泌和血液系统疾病，且未见明显肝肾毒性。

黄芪主要含黄芪多糖、黄芪皂苷、黄酮类、氨基酸和微量元素等。多糖类以葡聚糖和杂多糖为主。黄酮类有黄酮、异黄酮、异黄烷和紫檀烷四大类。皂苷类有黄芪皂苷及其大豆皂苷；氨基酸主要有氨基丁酸、天冬酰胺、天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸等25种；微量元素主要有Sc、Se、Cr、Mn、Co、Cu、Zn等。还含有生物碱、甾醇类物质、叶酸、亚麻酸、亚油酸、尼克酸、核黄素、维生素P、淀粉E 等。长期研究认为，黄芪的有效成分群主要为多糖、黄芪皂苷和黄酮，其中主要有效成分为黄芪多糖、黄芪皂苷Ⅳ、黄芪黄酮等。黄芪皂苷Ⅳ、毛蕊异黄酮及芒柄花素的含量可作为指标来评价黄芪药材的质量优劣。《中国药典》2010版将黄芪甲苷和毛蕊异黄酮苷作为指标性成分控制黄芪药材及制剂的质量。

1.1 黄芪皂苷Ⅳ

黄芪皂苷Ⅳ（Astragaloside Ⅳ，AST），又称黄芪甲苷或黄芪皂苷甲，分子式C41H68O14，分子量784.97，白色结晶或棕黄色粉末。现代药物化学研究确定，黄芪总苷（Astragaloside）是黄芪中具有心脑血管药理作用的标准药效组分。黄芪皂苷Ⅳ是一种羊毛酯醇形的四环三萜皂苷，为10多种黄芪皂苷的主要有效成分，生物活性最好，是评价黄芪及其制剂质量的定性定量指标。且许多中成药也以黄芪甲苷作为指标成分。黄芪皂苷Ⅳ具有护心、强心，保护大脑和内皮屏障功能损伤，抗胃溃疡，抑制胶原增生，改善血液流变学，抗衰老，调节免疫功能，保肝护肝、抗菌抗炎、降压、镇痛镇静、利尿、促进胰岛素分泌等作用。其抑制缺氧／复氧所致心肌细胞损伤的机制或以上调PKA-Cα 基因表达，提高受磷蛋白（PLN）16位丝氨酸磷酸化水平，解除PLN 对SER-CA2a的抑制，从而增强SERCA2a的功能。

1.2 黄芪多糖

黄芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）是黄芪的主要活性成分和发挥药理作用的关键物质，主要包括葡聚糖和杂多糖，其中葡聚糖有水溶性和水不溶性两种，分别是α-（1→4）（1→6）葡聚糖和α-（1→4）葡聚糖。APS多为水溶性，水溶液能使碘液变蓝，主要含葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖，少量含有糖醛酸由半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成；而有些仅由葡萄糖和阿拉伯糖组成。熔点＞200℃。各组分均有较大比旋光值，以D-型单糖和α-糖苷键为主，紫外图谱显示多糖的特征吸收峰。APS经水解后得到单糖，已鉴定的有L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、D-核糖、L-核糖、D-半乳糖，D-葡萄糖，D-甘露糖九种。APS对机体免疫系统具有较广泛调节作用，从而全面提高机体的免疫防御及免疫监视功能，增强机体抵抗外界不良因素的侵害。APS一方面可直接作用于免疫细胞，另一方面可通过神经-内分泌-免疫系统网络间的相互调节而发挥作用。可作为免疫促进剂或调节剂，可清除氧自由基，降低脂质过氧化，抵抗自由基损伤，具有强心降压、降血糖、抑菌、抗病毒、抗炎、抗癌、抗衰老、抗辐射、抗应激、抗氧化等药理功效。APS 还具有血脂调节作用，能有效地降低正常人血液中总胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白胆固醇水平，保护肝肾肺及血管的作用。注射用APS是目前较理想的安全有效肿瘤用药。

1.3 黄芪黄酮

黄芪黄酮（Flavonoids Astragalus，FA）是黄芪的活性有效成分之一，能够保护血管内皮细胞、抗氧化和抗动脉硬化，黄酮类成分是其保护心血管作用的主要有效成分之一，可作为鉴别黄芪药材质量的指标之一。至今大概分离得到将近40种黄酮类化合物，黄酮、异黄酮、异黄烷和紫檀烷共四大类。槲皮素、山奈黄素、异鼠李素、鼠李异柠檬素、羟基异黄酮、异黄烷、芦丁、芒柄花素、毛蕊异黄酮及其糖苷以及芒柄花素和芒柄花苷等。

药理学研究表明，黄芪黄酮具有调节免疫、抗心肌缺血、保肝、抗炎、抗突变、清除自由基等多种药理作用。药理学研究表明异黄酮是黄芪的有效成分之一，具有抗病毒、降血脂、抗氧化等作用。梁连生等研究发现，甘肃黄芪黄酮类化合物可剂量依赖性抑制血管紧张素II（AngII）诱导的内皮细胞凋亡，其机制或与降低被称为死亡受体的Fas相关。抗癌方面，张冬青等研究表明，黄芪总黄酮及毛蕊异黄酮等都具有抑制人红白血病K562细胞增殖的作用，可将细胞停滞在G0／G1 期，同时降低细胞内Cyclin D1mRNA 水平，或是其抑制K562 细胞生长的主要作用机制。黄芪黄酮有效部位提取物可有效抑制S180 肉瘤生长，显著提高血液及肝脏内SOD 活性，降低血液及肝脏MDA 含量，可促进肿瘤细胞的凋亡。

1.4 清洗水中COD

化学需氧量（Chemical Oxygen Demand，COD）是指在严格的条件下水中的还原性物质被氧化分解所消耗强氧化剂的量，反映水受还原性物质污染的程度，包括有机物、亚硝酸盐、亚铁盐、硫化物等还原性物质，但一般水及废水中无机还原性物质含量较低，而有机物污染更普遍，因此COD 可作为有机物质相对含量的一项综合性指标。

2 分析方法的确定方法

2.1 高效液相色谱法分析测定黄芪皂苷Ⅳ

高效 液 相 色 谱 法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一或混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器检测，从而实现对试样的分析。其应用范围广、分析速度快、载液流速快，可分析80%以上有机物，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析更显优势。通常分析一个样品仅需几分钟到几十分钟，一般小于1 h。色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收。

HPLC 法具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度高等优点，因此是黄芪甲苷含量测定中最为常用的一种分析方法。黄芪皂苷Ⅳ的HPLC 法测定应用较广，该法简单可靠，专属性好，C18色谱柱，常用的流动相为乙腈-水、甲醇-水、乙腈-水-磷酸、乙腈-水-四氢呋喃等，大多采用乙腈-水，但浓度比各有不同。UV 检测器为最常用的检测器，在检测波长的选择上，黄芪甲苷在近紫外区仅在200nm 左右处有弱的末端吸收，因此在200～210nm 左右选择测定波长。通常选用201～203nm，波长小，吸收强，干扰较大；而波长大，干扰小，吸收强度又较差，经衍生化的黄芪甲苷检测波长为230nm。王宗权等采用HPLC-ELSD 法测定不同产地黄芪药材中的黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅳ的含量。黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅳ的线性范围较宽，平均回收率较高，重现性好。方法简单快捷，适合于黄芪药材中黄芪皂苷的含量测定研究，为寻找更佳黄芪产地提供了依据。史静超等建立HPLC-ELSD 法测定黄芪中黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ的含量，采用C18色谱柱，乙腈-水为流动相。黄芪皂苷Ⅳ进样量的自然对数与峰面积积分值的自然对数成良好线性关系，平均回收率较高、重现性好。方法简便、准确，可用于黄芪的质量控制。梁瑾等建立HPLC-DAD-ELSD法同时测定黄芪药材中黄酮类和皂苷类成分的方法，比较15批不同产地的黄芪药材中各有效成分的含量，采用HPLC-DAD-ELSD联用法，乙腈-水为流动相。1 次进样，同时测定黄芪药材中毛蕊异黄酮、芒柄花素、黄芪皂苷Ⅳ、黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅲ的含量，线性关系良好。平均回收率高。方法简便，重复性好，可用于黄芪药材中黄酮类和皂苷类成分的同时测定和黄芪药材的质量控制。王培培等研究黄芪药材中黄芪皂苷的提取工艺及含量测定，采用薄层色谱法（TCL）、高效液相-示差检测器法（HPLC-RID）进行皂苷类成分的鉴定和含量测定，从黄芪总皂苷中分离出六种黄芪皂苷化合物（ASⅠ-ASⅥ），ASⅢ部分经鉴定主要含皂苷Ⅳ，质量分数为22.82%。方法能较好的分离和纯化黄芪皂苷，操作简便，可作为黄芪皂苷的鉴定和含量测定方法。汪祺等建立黄芪中皂苷类成分的液相色谱特征图谱。通过比较碱化处理前后皂苷类成分的变化，进一步证明碱性条件可以促使黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ转化为黄芪皂苷Ⅳ，并确定黄芪皂苷Ⅰ至Ⅳ为特征成分且各成分分离良好，方法简便易行，所选特征成分可用于黄芪中皂苷类成分的检查。

因此，以HPLC 法进行黄芪皂苷Ⅳ含量测定，已经是成熟、可靠的方法，本课题组拟采用HPLC法，对普通水清洗和不同超声频率和超声强度的超声波清洗后黄芪中黄芪皂苷Ⅳ的流失情况进行对比检验，并对普通清洗和超声波清洗黄芪后洗涤水中各项含量进行对比检验，以确定超声波清洗所需要的超声频率和超声强度及超声时间等。

2.2 紫外可见光谱法测定黄芪多糖和黄芪黄酮

紫外-可见吸收光谱法（UV-Vis）是利用物质分子对10～800nm 光谱区的辐射吸收光谱进行分析测定的方法，广泛用于有机、无机物的定性和定量测定。方法灵敏度、准确度较高，选择性好，操作简便快速。2.2.1 黄芪多糖的测定 黄芪多糖成分复杂，其含量的测定目前应用较广的为紫外-可见光谱法。苯酚-浓硫酸比色法是测定多糖含量较为经典有效的方法之一，其原理是黄芪多糖在浓硫酸作用下水解生成单糖，并迅速脱水生成糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10～100 mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在波长485 nm 下有特征吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚-硫酸法主要用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定。用苯酚-硫酸法测定黄芪多糖，对于黄芪多糖制剂的质量控制将得到一定的保证。此外，方法操作简单、试剂便宜、灵敏度高、具有实验时基本不受蛋白质存在的影响的优点，且产生的颜色可稳定160min以上。翟翠云等采用紫外光谱法（苯酚-硫酸法）对黄芪多糖进行含量测定试验。表明该法在线性关系、重复性、回收率和稳定性等方面令人满意，可用于黄芪多糖的含量测定。涂波等探讨了当归补血汤颗粒中黄芪甲苷和黄芪多糖的含量测定方法。采用高效液相色谱法测定黄芪甲苷的含量，采用苯酚-硫酸比色法测定黄芪多糖的含量，旨在为自制的当归补血汤颗粒质量评价奠定基础，结果表明，采用高效液相色谱法测定黄芪甲苷的含量，能实现黄芪甲苷与有关物质的有效分离，黄芪甲苷峰形好，含量测定结果重复性好；所用测定黄芪多糖含量的苯酚-硫酸比色法，具有准确可靠、灵敏度高、重现性好等优点，可用于评价当归补血汤颗粒质量的有效方法。张洪波等优选黄芪叶提取的常规方法和超声提取方法及确定黄芪多糖的含量测定方法，以超声波提取方法及应用苯酚-浓硫酸作显色剂，采用紫外-可见光谱法进行含量测定。结论是超声提取方法优于常规提取方法；用紫外-可见光谱法测定含量，简便快速，灵敏准确，适合黄芪多糖的含量测定。李孝栋等采用紫外光谱法测定黄芪中多糖的含量，通过对多糖部位的水溶部分、水不溶部分及二者混合物的多糖含量测定，表明水溶部分与水不溶部分总多糖的含量和二者混合物的多糖含量接近，结合多糖特性和Molish反应的阳性现象，提出用沸水代替冷水对黄芪多糖有效部位萃提的方法更具准确性，研究结果证明苯酚-硫酸法也可用于测定水不溶多糖。

2.2.2 黄芪黄酮测定 皂苷和多糖存在较大差异。徐东生以黄芪为试材，用微波消解仪提取黄酮，含量的测黄芪黄酮成分复杂，其取适合于提取黄酮类和多糖类成分，连续回流法适合于提取皂苷类成分，3种黄芪中含有的黄酮定目前应用较广的为紫外可见光谱法。江蔚新等研究蒙古黄芪、膜荚黄芪和天然黄芪中皂苷、黄酮、多糖的质量分数。采用连续回流提取法和超声波提取法提取蒙古黄芪、膜荚黄芪和天然黄芪根中的皂苷、黄酮、多糖，比色法测定其质量分数。结果表明，超声波法提光度法测定其提取率，研究黄芪黄酮的最佳提取条件。表明各种因素对提取效果影响的顺序为：提取温度＞乙醇浓度＞料液比＞提取时间。郝红梅等观察酵母发酵对黄芪药材中黄酮含量的影响。采用恒温振荡器对酵母菌悬液进行培养，利用紫外-可见光谱法对不同发酵时间下的药材发酵液中的黄酮含量进行比较。结果表明发酵法黄芪黄酮的产率较对照组提高了18%，最佳发酵期为7d。

2.3 普通和超声波清洗后洗涤水中COD 的测定

COD 测定方法主要有重铬酸盐法、高锰酸钾法、分光光度法、快速消解分光光度法。快速消解分光光度法的原理是试样加入已知量的重铬酸钾，在强硫酸介质中以硫酸银催化剂高温消解后，用光度法测定COD 值。该法测定时间短、二次污染小、试剂量小、费用低。为了检验黄芪在普通清洗和超声波清洗后，总有机质的流失程度，本课题组选择快速消解分光光度法对普通清洗和不同超声频率、不同超声强度的超声波清洗后水中有机质的含量（COD）进行测定，对比选择和确定超声波清洗的超声频率和超声强度及超声时间等。

3 小结

目前报道的黄芪的主要药效和质量标准成分为黄芪皂苷Ⅳ、黄芪多糖、黄芪黄酮等。基于以上黄芪各种主要有效成分的含量和重要药理作用，以黄芪皂苷Ⅳ、黄芪多糖、黄芪黄酮的含量，以及清洗后水中化学耗氧量COD 的改变作为普通水洗和不同超声频率、不同超声强度的超声波清洗黄芪，有效成分散失与否和散失量的定性和定量分析检测项目。初步选择和确定的测定方法是采用高效液相色谱法测定黄芪皂苷Ⅳ，采用紫外可见光谱法测定黄芪多糖和黄芪黄酮。清洗水中总有机物含量（以COD 量计）采用快速消解分光光度法测定，为根类中草药的超声波清洗技术提供理论和实验指导。

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