高分离度快速液相色谱—四极杆—飞行时间质谱法分析酒制和醋制人参的皂苷类成分

摘要；利用高分离度快速液相色谱与四极杆飞行时间质谱（RRLCQTOF MS）联用技术，对酒制人参和醋制人参的人参皂苷类成分进行比较研究。样品经不同方法炮制，离心过滤后，采用Agilent ZORBAX SBC18 色谱柱，以0.1% 甲酸和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，采用高分辨质谱进行检测，利用Masshunter Qualitative Analysis软件与人工相结合进行分析。鉴定了46种人参皂苷，比较了酒制人参和醋制人参中人参皂苷含量差异，并检测到稀有人参皂苷。同时总结了炮制品中人参皂苷的转化途径。对人参置于酒或醋中有效成分的浸出量进行比较。本方法对于人参炮制品的成分研究具有借鉴意义，并且对民间使用的人参泡酒进行了科学解释，为人参炮制品在临床合理使用提供指导。

关键词；酒制人参；醋制人参；人参皂苷；液相色谱质谱联用

1引言

人参是五加科植物人参（Panax ginseng C. A. Mey.）的干燥根，具有益智、提高免疫力、调节心血管系统等功效，主要有效成分是人参皂苷 [1]。人参皂苷属于三萜类化合物，共三类，分别是原人参二醇型皂苷（Protopanaxadiol，PPD）、图1原人参二醇型皂苷和原人参三醇型皂苷的结构式

当R3=OH为原人参三醇型皂苷，当R3=H为原人参二醇型皂苷。

R3=OH，panaxatriol ginsenosides； R3=H， panaxadiol ginsenosides.原人参三醇型皂苷（Protopanaxatriol，PPT）（骨架结构示于图1）和齐墩果烷型人参皂苷（Oleanolic acid）。按照其C20位结构的不同，又可以分为20（S）型和20（R）型，天然人参皂苷构型均为20（S）型。

人参有红参、生晒参、大力参等炮制品 [2～4 ]。研究表明，人参经过加工炮制后，所含有效成分发生复杂变化，同时伴有新物质生成[5]，民间将新鲜人参置于酒中浸泡后服用，达到保健的目的 [6]，但很少进行科学解释。中医理论中，药材经醋炮制后，可以增强治疗作用的例子有很多[7]。据报道，人参皂苷在酸性环境下能够转化成具有很强生物活性的稀有皂苷[8]。

高分离度快速液相色谱与四极杆飞行时间质谱（RRLCQTOF MS）联用技术常用于天然产物的化学成分分析[9]，Wang等[10]利用液相色谱质谱联用技术检测人参和西洋参中人参皂苷类化合物的差异，本实验利用液相色谱质谱联用技术，比较人参通过醋及酒炮制后的化学成分变化，为其质量评价和临床应用提供依据。

2实验部分

2.1仪器、试剂与材料

Agilent 1200型快速分离液相色谱系统，Agilent 6520 QTOF 质谱仪（美国Agilent公司）。鲜人参、生晒参（5年）均购于吉林省抚松县万良人参市场，经长春中医药大学王淑敏教授鉴定为五加科植物人参Panax ginseng C.A. Mey.的根）；人参皂苷Rg2， Rg3， Rb1， Rc， Rd， Re和Rf等对照品（纯度>98%， 南京泽朗医药科技有限公司）；乙腈（色谱纯）；其它试剂均为分析纯。醋（山西水塔醋业股份有限公司，总酸≥4.00 g/100 mL）；白酒（北京双庆和酒业有限责任公司，酒精度：56% Vol）；黄酒（浙江圣塔绍兴酒有限公司，酒精度：8% Vol）。

2.2样品的制备

鲜人参分别用3种浸泡液（醋、白酒、黄酒）浸泡48 h后，高压蒸锅100℃蒸制2.5 h，冷却至室温，于烘箱60℃干燥72 h。等量的浸泡液，备用。

分别称取1 g生晒参粉末，加入20 mL 70%甲醇，浸泡过夜，超声60 min，以5000 r/min 离心10 min，过0.22 μm滤膜，备用。浸泡液制备方法同上。

2.3实验条件

色谱条件：

色谱柱：Agilent ZORBAX SBC18 色谱柱 （100 mm×2.1 mm，3.5 μm），梯度洗脱； 流动相：0.1% 甲酸溶液（A），乙腈（B）； 流动相梯度：0～2 min，0%～10% B； 2～7 min，10%～15% B； 7～15 min，15%～30% B； 15～21 min，30%～39% B； 21～33 min，39%～50% B； 33～44 min，50%～68%B； 44～50 min， 68%～100% B。柱温35℃； 流速 0.3 mL/min； 进样量5 μL。

质谱条件： 采用电喷雾负离子扫描模式（ESI

Symbolm@@ ），干燥气（N2）流速9 L/min，干燥气温度300℃，雾化气压力2.41×105 Pa，毛细管电压为3.5 kV，碎裂电压175 V，锥孔电压65 V，质量扫描范围m/z 100～2000。实验数据采用Masshunter Qualitative Analysis（B. 03. 01）软件分析处理。

3结果与讨论

3.1线性范围和检出限

选择人参中主要成分人参皂苷Rg2和Rf为对照品，按照2.3节中色谱、质谱条件， 通过RRLCCeTOF联用技术分析计算线性范围和检出限。以浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明在0.025～2.5 μg/mL浓度范围内，Rg2对照品的相关系数为0.994，标准曲线线性关系良好。在0.1～10 μg/mL的浓度范围内，Rf对照品的相关系数为0.995，标准曲线线性关系良好。以3倍信噪比（S/N）计算得Rg2和Rf对照品的检出限分别为0.0010和0.0012 mg/kg（表1）。

[KH*4D][HT5”SS][HJ*4]表1对照品人参皂苷Rg2和Rf的线性范围、回归方程、线性相关系数、检出限

3.2不同炮制品化学分析及比较

人参皂苷在ESI负离子模式下的一级质谱图中，准分子离子主要以[M-H]

Symbolm@@ 的形式存在[11]。通过RRLCQTOF MS获得标准对照品提供的质谱信息和供试品一级谱中的分子质量信息，以及二级串联质谱分析得到碎片信息，确定苷元类型和所连糖基的种类和数量，进而确定人参皂苷结构。

实验数据采用提取离子流（EIC）方法分析。以丙二酰基人参皂苷mRb1为例，说明其它人参皂苷的鉴定方法。人参皂苷mRb1是二醇型人参皂苷，其C3 位取代是一分子丙二酰基和两分子的葡萄糖形成的侧链，C20位为两分子葡萄糖连接而成。丙二酰基人参皂苷mRb459 是二醇型人参皂苷的特征离子。这与文献＼[4＼]报道的信息一致，可推测此物质为人参皂苷mRb1。用同样的方法可以判定所测得的人参皂苷RRLCMS/MS数据（表2）。

表2为3种人参炮制品和生晒参的化学成分鉴定和相对含量比较。由于生晒参的炮制过程中未经过高温蒸制，因此生晒参的皂苷类成分中存在天然的丙二酰基类人参皂苷。而炮制品在这个过程中经过溶液浸泡和高温蒸制，会有一部分丙二酰基类人参皂苷水解脱去了丙二酰基，生成了相应的人参皂苷，如mRd经水解生成了Rd，因此在炮制品中类似Rd这样生成相应的人参皂苷的含量会明显增加。炮制品中存在着一些生晒参中没有检测出的成分，如人参皂苷Rh2， F2， Rg4， Rg5， Rg6， Rk3等。人参皂苷Rh2是重要的抗肿瘤活性成分，人参皂苷Rk3对顺铂所致的肾毒性具有保护作用，这些成分的变化是人参蒸制药效改变的物质基础[12]。有少数的人参皂苷含量上发生较大改变。例如， 在酸环境下人参皂苷主要的转化标志性产物为Rg3[13， 14]。这是由于人参皂苷C3位和C20的糖基不稳定造成的。醋制人参对人参皂苷的转化效果最明显。

W： 生晒参； V： 醋制人参； D： 白酒制人参； M： 黄酒制人参； 编号1～21为二醇型人参皂苷，编号22～34为三醇型人参皂苷，编号35为齐墩果烷型人参皂苷，编号35～46为其它类型皂苷。“-”代表未检测到，“+”代表峰面积为0～2×105，“++”代表峰面积为（2×105～5×105，“+++” 代表峰面积大于5×105。

W： White ginseng； V： Vinegar processed ginseng； D： Distilled spirit processed ginseng； M： Millet wine processed ginseng， No. 1-21： Panaxadiol ginsenosides； No.22-34： Panaxatriol ginsenosides； No.35： Oleanolic acid； No. 35-46： Others. “ -” ： No detected； “+” ： Peak area are less than 2×105； “++” ： Peak area are 2×105-5×105； “+++” ： Peak area are above 5×105.[BG）W][HT5][HJ]

3.3原人参二醇型人参皂苷转化途径

以醋制人参中的原人参二醇型人参皂苷转化途径为例，人参皂苷Rb1 （1108）， Rb2 （1078）， Rb3 （1078）， Rc （1078） 的C3位和C20分别连有不同的糖基，如人参皂苷Rb3在 RRLCQTOFMS一级谱中的准分子离子为[M-H]Symbolm@@ （m/z 1077.5851），在ESIMS/MS 条件下发生碎裂产生一系列碎片离子，其中m/z 945是m/z 1077离子失去C20位木糖基C5H8O4（132 U）碎片产生的，m/z 783是m/z 1077 离子失去C20位木糖基碎片并且失去一个葡萄糖基C6H10O5碎片产生的，m/z 621是m/z 1077离子失去C20位木糖基碎片且分别失去两个葡萄糖基C12H20O10碎片产生的，m/z 459是m/z 1077离子失去C20位和C3位所有取代糖基碎片产生的。炮制过程中，人参皂苷Rb1， Rb2， Rb3， Rc会发生C20位的取代基优先失去，C3位保持不变。即转化成人参皂苷Rd （946）。继续转化会有两条途径：第一条途径是人参皂苷失去C3位的葡萄糖基C6H10O5（162 u）和C20位的一个糖基，产生人参皂苷F2。F2失去C3位或者C20位的糖基后分别转化成人参皂苷CK和Rh2（图3）。第二条途径是人参皂苷失去C20位的糖基并且C3位的取代基不变，即转化成C20位R/S构型的Rg3。Rg3接着失去C3位的一个葡萄糖取代基，转化成人参皂苷Rh2。最后Rg3经过水合作用或者脱水作用分别可以生成人参皂苷CY和人参皂苷Rk1/Rg5（提取离子流图见图4）。RRLCQTOFMS一级谱中Rk1/Rg5的含量大于人参皂苷CY，可以说明脱水作用占主导。

3.4浸泡液的化学成分分析

在常温下，采用等量醋、白酒及黄酒浸泡相同质量的鲜人参，考察人参中有效化学成分的浸出含量，以峰面积作为比较单位（图5）。结果表明，浸泡液RRLCQTOFMS一级谱中可以检测到大量人参皂苷，含量依次是：醋>黄酒>白酒。浸泡液中人参皂苷含量差异的原因可能是人参皂苷更易溶于低pH值且极性大的溶液，而白酒浸泡液中的人参皂苷成分并不是最多的。民间使用人参泡酒服用的习惯，可能是由于古代保鲜防腐的手段有限，而作为一种流传至今的保鲜方法，或者由于白酒浸泡液的口感较好。

3.5小结

本研究表明，生晒参中主要的人参皂苷在炮制品中均可找到，而且人参皂苷含量相差不大，但炮制人参含有很多稀有人参皂苷，如人参皂苷Rh2， F2， Rg4， Rg5， Rg6和Rk3等。醋制人参转化生成人参皂苷Rg3效果十分明显，可以作为制备稀有人参皂苷的一种手段，同时对原人参二醇型人参皂苷转化途径进行系统研究。黄酒制人参浸出人参皂苷的效果优于白酒制人参，但稍逊于醋制人参。

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AbstractRapid resolution liquid chromatography coupled with quadrupoletimeofflight tandem mass spectrometry （RRLCQTOF MS/MS） was used for the comparative analysis of ginsenosides composition in white ginseng， vinegar processed ginseng， distilled spirit processed ginseng and millet wine processed ginseng. Under the optimal chromatographic conditions including ZORBAX SBC18 column （100 mm×2.1 mm， 3.5 μm） at 35℃， 5 μL of injection volume and wateracetonitrile gradient elution as mobile phase with a flow rate of 0.3 mL/min， 46 kinds of ginsenosides were identified by the comparison of the retention time of the standard compound and the accurate mass obtained from RRLCQTOF MS/MS. The rare ginsenosides were detected by the comparison of white ginseng with Processedginseng， such as ginsenoside Rh2， F2， Rg4， Rg5， Rk3 etc. The method has reference significance for the research of compounds in the processed Chineseherbs.

KeywordsProcessedginseng； Ginsenosides； Liquid chromatographymass spectrometry

（Received 12 March 2015； accepted 2 June 2015）