二茂铁功能化石墨烯修饰电极用于多巴胺的检测

刘超

摘要 通过酰基化反应制备二茂铁（Fc）功能化氧化石墨烯材料，利用透射电镜、傅里叶变换红外光谱和X射线衍射对该复合物的形貌和结构进行了表征。将其滴涂到玻碳电极（GCE）表面并用Nafion膜固定，进行电化学还原，得到电化学还原氧化石墨烯复合材料修饰电极（Fc/ERGO/GCE）。此修饰电极对多巴胺的氧化还原具有良好的催化性能，在循环伏安曲线的0.2 V附近出现一对多巴胺的可逆氧化还原峰。差示扫描伏安法（DPV）峰电流大小与多巴胺浓度在0.4～300 μmol/L范围内呈良好的线性关系（R2=0.9998），检出限为0.08 μmol/L。用于检测人体尿液中的多巴胺含量，加标样品的回收率在92.5%～105.0%之间，相对标准偏差小于5%（n=5），表明制备的Fc/ERGO/GCE可用于实际样品中DA的检测。

关键词；二茂铁； 电化学还原氧化石墨烯； 多巴胺； 电化学检测

1引言

多巴胺（DA）作为一种重要的儿茶酚胺类神经递质，具有调节肾脏功能、激素分泌等重要作用。许多疾病，如癫痫、帕金森病、精神分裂症等，都与DA浓度异常有关 [1 ]，因此，开发灵敏、特异性、快速的检测方法对于疾病诊断、神经生理学及相关药物研究有重要意义。目前，检测DA的主要方法有荧光法、紫外分光光度法、高效液相色谱法、电化学法等 [2～4 ]，与其它方法相比，电化学方法以其简单、灵敏度高、成本低和响应快速的优点引起了广泛的关注 [5，6 ]。由于DA在固体电极上的过电位较大，用未修饰的电极检测DA的灵敏度一般较低，因此修饰电极在DA的测定中越来越受到人们的重视 [7，8 ]。

石墨烯（Graphene）是碳原子紧密堆积成单层二维蜂窝状晶格结构的一种新型纳米材料，具有优良的导电性能和较大的比表面积，广泛用于能源储存、传感器和修饰电极等研究领域 [9]。二茂铁 （Fc） 是一种良好的电子转移媒介体 [10 ]，由于其电化学活性高，可逆性好，可作为蛋白质标记物或氧化还原活性中心用于生物小分子的检测 [11，12]。Yang等 [13]将Fc和单层碳纳米管通过非共价键连接制备成复合材料，该材料表现出良好的电催化性能 [13]，而通过共价作用制备Fc及其衍生物与石墨烯复合材料的报道很少 [14～16]，还未见将其用于多巴胺检测的报导。

本研究利用共价改性氧化石墨烯（GO）的方法制备了二茂铁功能化的氧化石墨烯（Fc/GO）复合材料，通过恒电位还原的方法将其还原成二茂铁/石墨烯（Fc/ERGO），然后修饰在玻碳电极上，采用循环伏安法和微分脉冲伏安法研究了DA在此修饰电极上的电化学反应，基于此建立了检测DA的电化学方法。

2实验部分

2.1仪器和试剂

CHI630D电化学工作站（上海辰华仪器公司）；JEM2010型透射电子显微镜（日本电子珠式会社）；Nicolet 5700红外光谱仪（美国Thermo Nicolet公司）；XD3型X射线衍射仪（北京普析仪器有限责任公司）；AR224CN型电子天平（奥豪斯仪器有限公司）；超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；101C2型恒温干燥箱（上海实验仪器厂）；CT14D型台式高速离心机（上海天美生化仪器厂）；采用三电极体系：自制的二茂铁/石墨烯修饰玻碳电极为工作电极（d=3 mm），AgAgCl（饱和KCl）电极为参比电极，铂丝为对电极。

二茂铁、石墨粉（8000目）、多巴胺（98%）（阿拉丁试剂公司）；Nafion溶液（5%，美国Sigma公司）。其它试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。0.1 mol/L Na2HPO4NaH2PO4缓冲溶液（PBS， pH 6.5）。

2.2实验方法

2.2.1氧化石墨烯（GO）及二茂铁/氧化石墨烯（Fc/GO）材料的制备采用改进的文献[17]的方法合成GO，具体步骤为：称取2.5g K2S2O8和2.5g P2O5，依次缓慢加入到12 mL浓H2SO4中，再加入3 g石墨粉，恒温80℃水浴下机械搅拌5 h，进行预氧化，然后用500 mL二次蒸馏水稀释，冷却后过滤，60℃过夜。将1.53 g NaNO3和70 mL浓H2SO4与上述石墨混合，不断搅拌，15 min内加入9 g KMnO4，在7℃反应2 h。移入35℃恒温水浴锅，搅拌4 h，加入138 mL二次蒸馏水。升温至95℃反应40 min，再加入420 mL水，搅拌30 min，终止反应。冷却后，不断搅拌下加入20 mL 30% H2O2，除去多余的KMnO4，沉降后倒去上层清液，加入5% HCl离心，透析7天，超声后得到GO

通过选择性FriedelCrafts酰基化反应合成Fc/GO：将3 g酸性Al2O3于150℃真空干燥箱中加热活化3 h，冷却至室温；将1 mmol二茂铁溶于5 mL二氯甲烷中，并吸附在酸性氧化铝上；将20 mg GO和0.7 mL三氟乙酸酐混合，加入上述反应物中，整个过程在N2氛围中进行，室温搅拌36 h。反应产物重悬于甲醇中，用Whatman 41号滤纸过滤后，用甲醇、二次蒸馏水、乙醇清洗，将滤液离心，硅胶层析柱分离纯化（石油醚为洗脱剂）得到Fc/GO。Fe/GO合成示意图如图1所示2.2.2修饰电极的制备、表征和应用将裸玻碳电极（GCE）依次用1.0、0.3和0.05 μm的Al2O3粉末在麂皮上打磨、抛光至镜面。用无水乙醇、蒸馏水超声清洗3 min。取7 μL 1 mg/mL Fc/GO乙腈溶液滴涂于玻碳电极表面。自然晾干，取2 μL 5%（V/V）Nafion溶液滴涂到电极表面，干燥后即得Fc/GO/GCE [18]。将Fc/GO/GCE置于0.1 mol/L PBS缓冲溶液（pH=6.5）中，用

Symbolm@@ 1.5 V恒电位还原20 min，得Fc/ERGO/GCE，备用。作为对比，将0.1 mg/mL GO溶液按上述同样方法处理，制备GO/GCE。

2.2.3修饰电极的表征采用透射电镜（TEM）表征Fc/GO的形貌，加速电压为200 kV，样品均匀分散在二次蒸馏水中，取适量滴于铜网上，常温下空气中晾干后进行测定。复合材料的结构由红外光谱（IR）表征，采用KBr压片法，待测物与KBr按质量比1∶100混合，充分研磨均匀后压片，扫描范围为400～4000 cm

Symbolm@@ 1。

在含适量DA的PBS中，以Fc/ERGO/GCE电极为工作电极，在

Symbolm@@ 0.2～0.6 V电位范围内，以50 mV/s的扫速记录循环伏安图。

微分脉冲伏安法（DPV）参数设置：起始电位

Symbolm@@ 0.2 V，终止电位0.6 V，电势增量5 mV，脉冲幅度50 mV，脉冲宽度50 ms，采样宽度40 ms，脉冲周期100 ms，静置时间30 s。

3结果与讨论

3.1二茂铁/氧化石墨烯材料的表征

由GO的TEM图（图2A） 可见，GO的薄层结构及其表面与边缘的褶皱呈透明形态。由Fc/GO的TEM图（图2B）可见，Fc粒子比较均匀地分散在GO上。

3.2电化学还原氧化石墨烯的表征

在0.1 mol/L PBS缓冲溶液（pH=6.5）中的恒电位还原如图3A所示。随着还原时间延长，电流增大，表明材料的导电性得到增强＼[20＼]。由XRD表征（图3B）可见，在2θ=11.6°附近出现GO的特征衍射峰，经恒电位还原后，GO表面含氧官能团被除去，11.6°的特征峰消失，在25.9°出现了一个较宽的峰，晶面间距变小，表明GO被还原为ERGO。

3.3多巴胺在修饰电极上的电化学行为

不同电极在含0.1 mmol/L DA的0.1 mol/L PBS缓冲溶液（pH=6.5）中的电化学行为如图4所示，DA在GCE（a）上响应电流较小，且峰电位差较大（208 mV），在ERGO/GCE上的响应电流小幅增加，当电极表面修饰FC/GO后，DA的峰电流明显增大，与玻碳电极相比，峰电位差降低到81 mV，可逆性得到了显著改善。这是由于二茂铁作为电子媒介体，促进了在电极和多巴胺之间的电子传递；此外，石墨烯具有良好的导电性，其褶皱结构增大了电极的表面积。

3.4pH值对多巴胺电化学行为的影响

图5为0.1 mmol/L DA在不同pH值的PBS缓冲溶液中的DPV响应图。pH<6.5时，DA的氧化峰电流随着pH值的升高而增大；pH=6.5时，峰电流达到最大值；pH继续增大，峰电流却逐渐降低。这可能是因为酸度增加导致Nafion膜表面结合了部分H+，不利于带正电荷的多巴胺的吸附＼[21＼]；当溶液为碱性时，可能会中和多巴胺的正电荷，使多巴胺的吸附有所下降。

3.5扫速对多巴胺电化学行为的影响

考察了扫速对DA电化学行为的影响。从图6A可见，氧化还原峰电流随着扫速（v）的增加而增大，氧化峰和还原峰电位分别略微正移和负移。当扫速从10 mV/s增加到50 mV/s时（图6B），氧化还原峰电流与扫速的平方根成正比，表明DA在Fc/ERGO修饰电极上的反应受扩散控制。当扫速从50 mV/s 增加到150 mV/s时（图6C），氧化还原峰电流大小与扫速成正比，表明是一个吸附控制过程，可能原因是当扫速过高时，DA没有足够的时间在修饰电极膜中扩散＼[22＼]。为了提高信噪比，减小背景电流，选择50 mV/s作为最佳扫描速度。

3.6检测多巴胺的线性范围和检出限

在优化条件下，Fc/ERGO/GCE对不同浓度的DA的DPV响应曲线如图7A所示。随着多巴胺浓度的增加，DPV峰电流明显增大。响应电流值与DA浓度在0.4～300 μmol/L范围内呈线性关系（图7B），回归方程为I（μA）=0.2071C（μmol/L）-0.00517（R2=0.9998）；检出限（LOD）为0.08 μmol/L （S/N=3），优于文献报道的1.4 μmol/L[23]和1.9μmol/L[24]。

3.7电极的重现性、稳定性和干扰研究

对0.1 mmol/L DA溶液连续测量9次，相对标准偏差小于3%。将电极置于空白溶液中，室温放置10天后，响应值是初始响应的94.8%，说明修饰电极具有良好的重现性和稳定性。测定含有5 μmol/L多巴胺和500 μmol/L抗坏血酸（AA）的混合溶液的DPV响应，实验条件下，AA以阴离子形式存在，同时Nafion本身带负电排斥阴离子，所以Fc/ERGO/ GCE对AA没有响应，混合物的DPV曲线和单独DA的DPV曲线基本重合。此外，100倍的Na+、Mg2+、Ca2+、Al3+和100倍的葡萄糖、蔗糖、色氨酸、酪氨酸对5 μmol/L多巴胺的检测均无明显干扰。

3.8尿样分析

取2 mL正常人尿液，用0.1 mol/L PBS（pH=6.5） 定容至100 mL，同时添加一定浓度的DA标准品进行检测，结果见表1。加标样品的回收率在92.5%～105.0%之间，相对标准偏差小于5%（n=5），表明制备的Fc/ERGO/ GCE可用于实际样品中DA的检测。

4结 论

制备了二茂铁/电化学还原氧化石墨烯复合材料，此材料能有效提高多巴胺在电极表面的电子传递速率，对多巴胺的氧化还原反应表现出较高的电催化活性。二茂铁/电化学还原石墨烯修饰电极制备简单，对多巴胺检测线性范围宽、灵敏度高、检出限低，可用于实际样品中多巴胺的检测。

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AbstractA complex of ferrocene functionalized graphene oxide （Fc/GO） was prepared through FriedelCrafts acylation method and characterized by tunable electron microscopy （TEM）， Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR） and Xray diffraction （XRD）. The Fc/GO complex was immobilized on glassy carbon electrode （GCE） with Nafion， and electrochemically reduced by potentiostatic reduction method to get Fc/ERGO/GCE. The results showed that the obtained Fc/ERGO/GCE had good catalytic performance for the oxidationreduction of dopamine （DA）. A pair of peaks near 0.2 V in the cyclic voltammogram attributed to DA was observed. The differential pulse voltammetric （DPV） peak current was proportional to the concentration of DA in the range from 0.4 μmol/L to 300 μmol/L （R2=0.9998）， with a limit of detection of 0.08 μmol/L. The recoveries of DA in the spiked human urine samples were 92.5%-105.0% with relative standard derivations （RSDs） of less than 5% （n=5）， which indicated that the fabricated Fc/ERGO/GCE was suitable for the determination of dopamine in real samples.

KeywordsFerrocene； Electrochemically reduced graphene oxide； Dopamine； Electrochemical determination

（Received 27 March 2015； accepted 27 May 2015）