鸭坦布苏病毒病发病模型的建立

周晓波　李 银　杨 凌　朱 明　卞红春

（①江苏省盐城市畜牧兽医站　224000　②江苏省兽医研究所）

鸭坦布苏病毒病发病模型的建立

周晓波①李 银②杨 凌①朱 明①卞红春①

（①江苏省盐城市畜牧兽医站224000②江苏省兽医研究所）

摘要为疫苗的研究提供工具，建立鸭坦布苏病毒病发病模型，将168只35日龄无坦布苏病毒感染的樱桃谷肉鸭随机分成7组，每组24只，其中1～6组分别以不同含量的鹅源坦布苏JS804株病毒肌肉注射进行攻毒，对照组肌肉注射相同剂量的PBS。攻毒后每天观察临床症状。分别于攻毒后2、4、6、8、13、20d每组随机取4只攻毒鸭扑杀，分别取每只鸭各脏器样品2份，一份放-20℃冻存，用于套式RT-PCR检测病毒；另一份用4%多聚甲醛固定，用于免疫组织化学分析和组织病理学分析。结果表明：试验鸭于攻毒后腿瘫、头颈扭曲、行走不稳；各主要脏器均出现病变，其中以脾脏、肝脏、脑最为明显；套氏RT-PCR，攻毒后8日各脏器病毒阳性检出率最高，其中以脾脏检出率最高；由攻毒检测结果确定鸭的攻毒量为1.6×106TCID50。脑神经元细胞变性、坏死；肝细胞水泡变性、肝小叶结构破坏；脾脏淋巴细胞变性、坏死。免疫组化定位发现：心肌纤维细胞、脾脏生发中心、肺泡上皮细胞、肾小球上皮细胞、脑血管内皮细胞、肝细胞均有棕黄色阳性信号。本试验成功建立了鸭坦布苏病毒病樱桃谷肉鸭发病模型，为今后研制疫苗及免疫效果判定奠定了基础。

关键词鸭坦布苏病毒病发病模型免疫组织化学

从2010年4月起，我国东南水禽养殖大省（市、自治区）的鸭、鹅发生一种以采食量显著下降、产蛋严重下降、具有脑炎样神经症状的传染病［1，2］。发病的种鸭、蛋鸭产蛋率大幅下降甚至绝产，其死亡率为2%～15%，肉鸭、肉鹅死亡率为10%～55%，给鸭鹅养殖业造成巨大的经济损失。通过流行病学调查、病原分离、动物回归试验及基因测序分析等，已证实该病为不同于现有资料报道的一种新发黄病毒感染［3～7］。2011年，中国畜牧兽医学会第一届水禽疫病防控研讨会将该病统一命名为“鸭坦布苏病毒病”。为研究坦布苏病毒病的发病机制和将来研制疫苗提供帮助，本试验开展了鸭坦布苏病毒病发病模型建立的研究。

1　材料与方法

1.1毒株与试验动物鹅源坦布苏病毒JS804株由江苏省农业科学院兽医所禽病研究室分离、鉴定、保存；35日龄樱桃肉鸭购自丹阳某养鸭场，ICR乳鼠购自扬州大学比较医学实验中心。

1.2主要试剂和仪器DNA抽提试剂盒、AMV Reverse Transcriptase、Random Primer（9mer）、rTaxDNA聚合酶及DNA marker（DL2000）购自Takara公司；免疫组织化学所用一抗为本实验室保存的鼠源多抗（效价1:5000）；PBS液（0.01M，pH=7.2）、柠檬酸缓冲液（0.01M，pH=6.0）、4%多聚甲醛溶液、即用型SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒、切片石蜡（56～58℃）、中性树胶均购自博士德生物制药有限公司。RM2015病理切片机、徕卡HI1210摊片机购自德国徕卡仪器有限公司；隔水式电热恒温培养箱购自上海市跃进医疗器械一厂。

1.3病毒TCID的测定病毒增殖后按照殷震方法［8］50接种BHK-21细胞，测定病毒毒价。

1.4试验动物分组与攻毒168只35日龄无坦布苏病毒感染的樱桃谷肉鸭，随机分成7组，按表1进行攻毒。

表1　分组与攻毒情况　　　　　　 （只、ml）

隔离分开饲养，攻毒后每天观察临床症状，分别于攻毒后2、4、6、8、13、20d分6批次进行剖杀取病料，每次每组随机抽取4只，放血处死。快速取每一组织器官各两份，一份用4%多聚甲醛固定，用于免疫组织化学和病理学分析；另一份放-20℃冻存，用于套式RT-PCR检测病毒。

1.5剖检病变观察剖杀鸭子时注意观察肝脏、脾脏、脑、心肌等是否有病变并进行拍照。

1.6套式RT-PCR检测按照RNAiso plus试剂盒说明书要求从病料提取总RNA，参照黄欣梅等［9］的介绍合成引物，进行套式RT-PCR。取10μl PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳并观察结果。

1.7主要脏器组织病理观察将扑杀鸭各器官经4%多聚甲醛溶液固定，制备石蜡切片［10］，经苏木精-伊红染色［11］后镜检，观察病理变化。

1.8主要脏器免疫组织化学（IHC）分析取扑杀鸭各器官经4%多聚甲醛溶液固定24h以上，SABC法进行免疫组织化学［12，13］分析。

2　结果

2.1病毒的滴度增殖的病毒在BHK-21细胞上测定的病毒毒价为106.30TCID50/0.1ml。

2.2临床症状及剖检变化（1）临床症状：第1组鸭攻毒后第2天开始精神不振，采食量开始下降；第6天1～5组攻毒鸭采食量均显著下降，排白绿色粪便；第15天食量开始恢复，白绿色粪便逐渐减少；第20天采食量等均恢复至正常水平。攻毒后第4天有轻微神经症状，轻度腿瘫；第8天神经症状明显，表现腿瘫、趴卧、头颈扭曲、行走不稳、共济失调，躺卧时两腿向后伸展，严重的倒地不起；第16天神经症状逐渐减轻；第20天神经症状消失。攻毒鸭与对照鸭相比长势慢、体型小、瘦弱。6组没有明显症状，7组无肉眼可见症状。（2）剖检变化：1组鸭攻毒后4d肝脏轻微肿大，边缘轻微出血；脾脏轻微肿大，局部坏死。攻毒后6d肝脏肿大，边缘出血；脾脏肿大，局部有小坏死灶；腿肌轻微出血；心脏外壁出血，个别心内膜出血；脑水肿、充血。攻毒后8天脾脏斑驳似大理石样外观，肿大坏死，形似乒乓球；肝脏肿大呈土黄色，边缘出血或淤血；脑膜出血，脑轻度水肿、充血、有散在的出血点；腿肌出血；心肌外观苍白，有白色条纹状坏死，有的心脏外壁有出血，多数病例心脏内膜出血；肺脏淤血、水肿；肾脏充血，轻微肿大；胰脏有轻微的出血或坏死点。2组鸭剖检病变同1、3、4、5组病变依次减轻。6组没有明显病变，7组无病变。

2.3套式RT-PCR检测（1）1组攻毒后8d套式RT-PCR检测结果：具体结果见图1。1组攻毒后其它时间和其它各组攻毒后套式RT-PCR检测结果见表2、3、4。（2）1组鸭扑杀后套式RT-PCR阳性统计情况：具体结果见表2。（3）各组鸭不同时间扑杀后套式RT-PCR阳性率统计结果：具体结果见表3。（4）各组鸭不同时间扑杀后各脏器套式RT-PCR阳性率统计结果：具体结果见表4。

图1　1组攻毒后8d各组各脏器检测结果

表2　1组鸭扑杀后套式RT-PCR阳性统计分析结果　　（%）

表3　各组鸭攻毒后不同时间扑杀后套式RT-PCR阳性率　（%）

表4　不同组鸭扑杀后各脏器套式RT-PCR阳性率　　（%）

从表3和表4可以看出：3组在攻毒后8d检测率高达100%，攻毒后不同时间脾脏平均检测阳性率高达66.7%。2.4病理组织学变化选择3组做组织病理学分析，主要脏器均出现病理病化，尤其以脑、肝脏、脾脏病变最为明显，均出现了组织结构破坏、细胞坏死，对照组未见明显病理变化。病理变化见图2。

图2　病理组织学观察结果（HE染色× 400）

2.5免疫组织化学分析选择攻毒组3组进行免疫组织化学分析，在心脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑组织均发现阳性细胞，尤其以脾脏、脑组织内居多。具体结果见图3。

图3　免疫组化分析结果（IHC染色×400）

3　讨论

（1）鸭坦布苏病毒是流行于我国的一种新型黄病毒病，从2010年4月起发生在我国东南部，迅速蔓延至我国主要养鸭省市包括浙江、江苏、江西北京、湖北等［2-5，14-16］地，给养鹅、养鸭业带来巨大的经济损失。（2）本研究选择35日龄樱桃谷肉鸭，腿肌肌肉注射鹅黄病毒JS804毒株。通过临床症状、组织病理学、免疫组织化学等方面来研究攻毒模型。临床症状表明攻毒剂量越大的组症状越严重；临床剖检也是攻毒剂量越大的组眼观病变越严重；套氏RT-PCR攻毒剂量越大的组，各个组织器官检测率更高。此结果相一致，说明在一定范围内，攻毒剂量的高低同发病严重程度呈正相关。（3）攻毒组3组（1.6× 106TCID50）试验鸭，临床出现腿瘫、排白绿色粪便、行走不稳等症状；剖检各主要脏器可见眼观病变，尤以脾脏明显；套式RT-PCR检测是阳性，第8天脾脏检测率最高；组织病理学发现脾脏、肝脏、脑等脏器病变严重；免疫组织化学分析，脾脏、脑组织阳性细胞居多。所以，临床、剖检、套式RT-PCR、病理组织学、免疫组织化学均表明：本试验已成功建立了鸭坦布苏病毒发病模型，即34日龄樱桃谷肉鸭的攻毒量是1.6×106TCID50，攻毒后8d发病最严重，脾脏检测率最高。

鸭坦布苏病毒病发病模型的成功建立，为今后坦布苏病毒病疫苗的研制和免疫效果的判定奠定了基础。

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中图分类号：S858.293

文献标识码：A

文章编号：1007-1733（2015）02-0005-03

收稿日期：（2014-11-20）