玉米糖渣成分分析及酶解法提取蛋白的工艺优化

左莹，张萍，曹雪丹，张惠，张新华

（1.宁夏职业技术学院生物与制药技术系，宁夏银川750021；2.浙江省农业科学院柑橘研究所，浙江台州318020；3.新疆阿克苏地区农业技术推广中心，新疆阿克苏843000）

玉米糖渣成分分析及酶解法提取蛋白的工艺优化

左莹1，张萍1，曹雪丹2，张惠1，张新华3

（1.宁夏职业技术学院生物与制药技术系，宁夏银川750021；2.浙江省农业科学院柑橘研究所，浙江台州318020；3.新疆阿克苏地区农业技术推广中心，新疆阿克苏843000）

以玉米淀粉糖渣为研究对象，采用酶法水解糖渣中的蛋白，并优化酶催化法提取蛋白的工艺条件，结果表明：糖渣中蛋白含量最高33.1 g/100 g，尤其是谷氨酸、亮氨酸等呈味氨基酸含量较高，符合开发成为调味品或食品添加剂的基本要求；通过不同酶品种水解糖渣进行蛋白提取，结果表明，碱性蛋白酶提取率最高29.02%；采用单因素结果分析结合正交实验优化糖渣中蛋白分离工艺，结果为提取温度45℃，pH11.5，加酶量1%，料液比1∶11（体积比），提取时间为3 h时提取率可达39.77%；对所提蛋白中氨基酸组分分析可知谷氨酸、亮氨酸含量较糖渣中含量增加最多，分别可达8.332和6.089，具有开发利用的价值和潜力。

玉米淀粉糖渣；酶法；提取蛋白

玉米淀粉糖渣是玉米淀粉在制糖工业或发酵企业制糖工段经双酶法制糖后过滤糖液得到的滤渣，产量很大，具不无完全统计每年仅发酵企业就产生高达1 500 t玉米淀粉糖渣。随着以玉米淀粉为原料的发酵及制糖企业生产规模的不断扩大，糖渣副产物亦随之增多，使企业的环保压力越来越大；若简单热风干燥以饲料出售，能耗高、产品附加值低。然而对玉米淀粉糖渣理化分析发现其蛋白含量较丰富，达到30%以上。且有文献报道，来源于玉米淀粉糖渣的蛋白更是不含重金属等毒性物质、富含脂类、糖类等成分，含有大量呈味氨基酸、具有良好的消化性和高营养价值。具有开发成调味品、食品添加剂、功能性蛋白质粉、膳食蛋白添加剂的潜力[1-2]。本课题拟采用酶法催化玉米淀粉糖渣水解，确定最适酶的品种，并优化催化玉米淀粉糖渣中蛋白分离的催化条件，以提高蛋白提取率，并对分离蛋白中氨基酸成分进行分析，功能特性进行评定，将为探索玉米淀粉糖渣的深加工、解决企业废料环境污染问题，延长产业链等提供前期试验数据与技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米淀粉制糖后糖渣：伊品生物技术有限公司；酸性蛋白酶（30 000 U/g）、中性蛋白酶（30 000 U/g）、碱性蛋白酶（100 000 U/g）：夏盛实业有限公司；Folin-酚法所用试剂、苯酚硫酸法等所用试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

HH—2数显电热恒温水浴锅-双孔：杭州拓兴实验仪器厂；DHG-9023A电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；雷磁PHS-2酸度计：上海精科仪器厂；MGLG20-W台式高速离心机：北京中西远大科技有限公司；RT-12高速粉碎机：北京普诺众达科技有限公司；752Pro紫外可见分光光度计：上海棱光技术有限公司；L-8900全自动氨基酸分析仪：日立高新技术公司；E02140型电子分析天平：梅特勒—托利多仪器上海有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 感官及理化成份分析

粗蛋白含量的测定按GB/T5009.5-2010《食品中粗蛋白含量的测定》[3]；粗脂肪含量的测定按索氏抽提法GB/T14772-2008《食品中粗脂肪含量的测定》[4]；水分含量的测定按直接干燥法GB/T5009.3-2010《食品中水分的测定》[5]；灰分含量的测定按直接灰化法GB/ T5009.4-2010《食品中灰分的测定》[6]。

1.3.2 蛋白提取工艺

参考陈中爱[2]的方法，准确称量15.0 g糖渣，加去离子水适量，调节pH，加酶液，在既定的温度下搅拌进行反应，水解完毕后在80℃下灭酶15 min，然后离心分离，取上清液测定蛋白质含量。

1.3.3 酶品种筛选试验

参考陈中爱[2]的方法，以提取率为指标进行筛选，从酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶3种酶中选出提取蛋白效果最好的一种，这3种酶均在各自的最适条件对糖渣进行水解。

1.4 单因素对酶催化蛋白质提取工艺优化

有文献[2]显示，加酶催化时的温度、pH、加酶量、提取时间和料液比（体积比）等催化条件都会对催化效果产生显著影响，参考陈中爱[2]等的方法，对碱性蛋白酶进行以上因素的单因素试验，确定单因素试验的最优催化条件。

1.5 正交试验优化蛋白酶催化条件

在单因素试验结果的基础上，以蛋白质提取率为主要参考指标，设计五因素四水平的试验如表1。

表1 蛋白酶催化条件正交试验因素水平设计Table 1Orthogonal factor level design of protease catalyticconditions

拟确定各因素对蛋白提取率的显著性，并在此基础上确定各因素的最佳组合条件。试验结果数据采用SPSS软件进行分析。

1.6 酶处理前后氨基酸组分分析

对于玉米淀粉糖渣干粉与经酶处理后的玉米淀粉糖渣中氨基酸的组分采用氨基酸分析仪测定氨基酸含量[7]，并对酶处理前后各氨基酸组分变化进行比对分析。

1.7 蛋白含量的测定

参考陈中爱[2]的方法，采用Folin-酚法测定提取液中的蛋白质含量，以牛血清白蛋白做标准曲线。蛋白质固体：采用凯氏定氮法。

1.8 蛋白提取率计算

粗蛋白提取率（%）=提取蛋白粗品的克数/干渣样品中蛋白的克数×100

2 结果与分析

2.1 感官与理化分析

玉米制糖脱糖后糖渣感官分析结果如表2，湿渣呈淡黄色团块状气味微酸，干渣颜色略深（分析与热干燥有关），呈棕黄色，无明显气味。对糖渣的理化成分结果如表3，渣中蛋白含量33.1 g/100 g（占干物质33.1%），此外还有23.7%的糖类物质和少量的脂肪（9.74 g/100 g）、灰分（4.79 g/100 g）等。糖渣中蛋白质含量较高，有文献显示其中的重金属含量也远在国家食品标准的限度以下[8]，具有开发成为食品添加剂或功能性食品的前提条件。

表2 玉米淀粉糖渣感官分析Table 2Sensory analysis of corn starch sugar residue

表3 玉米淀粉糖渣理化指标检测Table 3Physical and chemical indicators to detect of corn starch sugar residueg/100 g

2.2 酶品种的筛选

酶品种的筛选见表4。

表4 催化玉米淀粉糖渣蛋白质水解的酶品种的筛选Table 4Catalyze the hydrolysis of corn starch sugar residueprotein enzyme screening varieties

本试验中选选取中性蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶3种酶对粉碎后的玉米淀粉干渣进行蛋白的酶解催化提取。由于不同种类的蛋白酶的作用于蛋白质的机理和酶催化动力学特征不同导致提取效果有明显不同。由表4结果可知，碱性蛋白酶的提取效果在所选3种酶制剂中最好，提取率达33.14%，有文献显示糖渣蛋白主要是碱溶性的谷蛋白，稀碱可以使渣中淀粉结构变得松散，对蛋白质和淀粉的分离起到了促进作用[9]，同时碱性蛋白酶是一种内切肽酶，能够水解多种蛋白，提取率相对较高，且售价合理。所以，本试验采用碱性蛋白酶。

2.3 单因素试验

2.3.1 温度对蛋白质提取率的影响

在料液比1∶9、提取时间4 h、酶量1.00%、pH 11的条件下，分别选取35、40、45、50、55、60℃作为试验温度，测定蛋白提取率，结果如图1

图1 温度对蛋白提取率的影响Fig.1 Effects of temperature on the extraction rate of protein

由图1可知，在温度为45℃下，蛋白质提取率最高，当温度超过45℃时，随着温度的升高提取率有所下降，原因可能是温度过高，酶蛋白质在长时间受热的影响下空间结构发生变化，尤其是具有催化活性的四级结构发生变化，易变性，同时由于疏水基团的暴露和展开、蛋白质分子的聚集，使糖渣中的蛋白质溶解度下降，导致酶提时蛋白质提取率下降[2]。

2.3.2 加酶量对蛋白质提取率的影响

在料液比1∶9、提取时间4 h、提取温度45℃、pH11的条件下，分别选取酶量0.2%、0.5%、0.8%、1.0%、2.0%、4.0%作为试验条件，测定蛋白提取率。如图2所示。

图2 加酶量对蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of enzyme concentration on the extraction rate of protein

在加酶量为0.20%～1.00%的范围内，蛋白提取率随着酶用量的增加而增大。当酶的添加量为1.00%时，蛋白提取率最高，继续增大酶量，提取率下降。随着酶用量的继续增加，糖渣蛋白的得率逐渐减少，可能是刚开始加入酶的时候，底物与酶的活性部位迅速结合转变成产物，随着反应的进行底物已饱和，酶浓度过高会使部分蛋白质水解，综合提蛋白效果和经济成本，酶量确定为1.00%。

2.3.3 pH对蛋白质提取率的影响

在提取时间4 h、提取温度45℃、酶量1.00%、料液比1∶9条件下，分别选取pH为9、9.5、10、10.5、11、11.5、12作为试验条件，测定蛋白提取率。糖渣蛋白80%以上是碱溶性谷蛋白，因此选择的试验pH条件都是在碱性条件下。从图3可以看出随着pH的增大，提取率呈增大的趋势，pH为11.0时，糖渣蛋白提取率达到33.17%。

图3 pH对蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of pH value on the extraction rate of protein

一般情况下，蛋白在胚乳中与淀粉结合较紧密，难以溶出，碱性环境能使它们的紧密结构变得疏松，促使蛋白与淀粉的分离。但是当pH过高，如增加到11以上时，大米蛋白的提取率反而有些下降，这是由于淀粉在碱性条件下糊化后黏度增大，阻碍了蛋白质的溶出[10]。因此确定提取糖渣蛋白的pH为11.0。

2.3.4 糖渣料液比对蛋白质提取率的影响

在提取时间4 h、提取温度45℃、酶量1.00%、pH为11条件下，分别选取料液比为1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13、1∶15作为试验条件，测定蛋白提取率，结果见图4。

图4 糖渣料液比对蛋白提取率的影响Fig.4 Effect of sugar residue liquid ratio on the extraction rate of protein

从图4可以看出随着料液比比例的减少，提取率呈增大的趋势，当达到1∶11时达到最高，糖渣蛋白提取率达到28.8%，之后进一步减小料液比，提取率略有下降，综合考虑提取率和节能减排等因素，确定料液比1∶11为最适料液比。

2.3.5 催化时间对蛋白提取率的影响

在提取温度45℃、酶量1.00%、料液比1∶9、pH 11的条件下，分别选取时间为1、2、3、4、5、6h作为试验条件，测定蛋白提取率。结果见图5。

图5 催化时间对蛋白提取率的影响Fig.5

由图5可知，在提取初期，蛋白质提取率随着提取时间的延长而升高，提取时间在4 h时提取率最大；之后，提取率逐渐下降。这可能与部分溶出蛋白质可与残留淀粉重新结合，使提取率下降有关，也有文献显示蛋白酶催化玉米蛋白质水解时或作用于氨基肽键，或作用于羧基肽键，也会分解掉部分氨基酸导致其提取率下降[9]。因此确定最佳提取时间t为4 h。

2.4 正交试验结果与分析

正交试验结果与分析如表5，方差分析如表6。

表5 蛋白酶催化条件正交试验结果与直观分析Table 5Results of orthogonal test of catalytic conditions ofprotease and visual analysis

表6 蛋白酶催化条件正交试验方差分析Table 6Analysis of variance of orthogonal test of protease catalytic conditions

由表5和表6可知，影响蛋白酶催化条件的主次因素依次为pH（A）＞加酶量（B）＞料液比（E）＞提取时间（D）＞提取温度（C），对各因素不同水平均值进行比较，以A4B2C2D1E3组合为最佳条件，即在pH11.5，加酶量1.0，料液比1∶11，提取时间3小时和提取温度45℃条件下为正交分析最优化条件，与单因素试验结果基本一致。其中pH、加酶量、料液比对提取率有显著影响（a=0.05）。

2.5 验证试验

通过对正交结果的试验条件进行验证，即在在pH11.5，加酶量1.0，料液比1∶11，提取时间3小时和提取温度45℃条件下再次提取玉米淀粉糖渣中的蛋白，蛋白提取率达33.77%。

2.6 酶解法处理前后氨基酸组分分析

采用氨基酸分析仪分别测定糖渣和经碱性蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶分别催化后的样品中氨基酸组分的含量，结果如表7所示，碱性蛋白酶处理样品中氨基酸组分的增长量最大，总氨酸达42.045 4，其次是中性蛋白酶处理的样品，而酸性蛋白酶的结果有所减少，分析原因，可能与玉米蛋白中的氨基酸多为

碱溶性蛋白有关，且其中的谷氨酸、天冬氨酸和亮氨酸的增幅最大，谷氨酸是提鲜的呈味氨基酸，天冬氨酸具有保护心肌和降低血压的医疗作用，而亮氨酸也是常用的营养增补剂和增味剂[11]，在食品行业中有广泛的用途，具有进一步加工成食品调味剂和功能性食品的潜力。

表7 不同酶品种催化玉米淀粉糖渣水解后氨基酸成分分析Table 7Analysis of amino acid composition in different enzymes catalyze the hydrolysis of corn starch sugar residue

3 结论与讨论

1）玉米淀粉糖渣中富含蛋白质、糖类和脂类物质，且重金属含量低于食品限量，具备开发为功能性蛋白粉、呈味剂或提鲜剂等食品添加剂的前提条件。

2）经单因素优化试验表明，采用45℃、1%加酶量、pH11和料液比1∶11体积比的提取条件，蛋白质提取率最高。在此基础上，进行正交试验，其结果表明各因素对糖渣蛋白提取率影响程度依次为：pH（A）＞加酶量（B）＞料液比（E）＞提取时间（D）＞提取温度（C），因此确定最佳提取工艺条件为pH11.5，加酶量1.0%，料液比1∶11，提取时间3小时和提取温度45℃，经正交试验结果验证在最佳工艺条件时的提取率为33.77%。

3）糖渣蛋白提取工艺的报道主要集中在碱法，酶法、碱酶或双酶分步法。碱法提取的是80%的碱溶性谷蛋白，酶法提取的是水溶性蛋白、醇溶蛋白及难溶性蛋白，且抗氧化活性可以得到很好的保持，采用酶法提取反应条件温和，反应的固液比小，提取率不高，纯度也较低，但酶法提高了蛋白质的溶解性，蛋白经部分酶解提高了营养价值，有利于消化、吸收，而且糖渣蛋白特定肽链的降解还可能产生具有多种活性的生物活性肽，具有更高的开发价值[11]。

4）正交优化碱性蛋白酶的催化条件，可以有效提升玉米淀粉糖渣中谷氨酸、亮氨酸等的含量，对玉米淀粉糖渣的开发和企业废渣的有效利用提供了理论依据，但提取率还有些低，有文献报道采用中性蛋白酶和碱性蛋白酶双酶法水解大米糖渣，可以提高蛋白质的提取率，并使蛋白质中多种呈味氨基酸和功能性小肽的含量增加[12]，该方法也是玉米淀粉糖渣今后可以进一步研究的方向。

[1]高东宁,曹磊,许赣荣.以玉米淀粉糖渣为原料制备米曲发酵酱油[J].生物加工过程,2011,5(3)61-65

[2]陈中爱,曾海英,董宏伟酶法提取糖渣蛋白的工艺研究[J]食品科技,2011,6(38):236-241

[3]中华人民共和国卫生部.GB/T5009.5-2010食品中粗蛋白含量的测定[S].北京:中国标准出版社,2010

[4]中华人民共和国卫生部.GB/T14772-2008食品中粗脂肪含量的测定[S].北京:中国标准出版社,2008

[5]中华人民共和国卫生部.GB/T5009.3-2010食品中水分的测定[S].北京:中国标准出版社,2010

[6]中华人民共和国卫生部.GB/T5009.4-2010食品中灰分的测定[S].北京:中国标准出版社,2010

[7]中华人民共和国卫生部.GB/T5009.5-2010食品中氨基酸的测定[S].北京:中国标准出版社,2003

[8]高东宁.玉米淀粉糖渣为原料培养米曲和红曲及酱油酿造[D].无锡:江南大学,2010

[9]奚海燕,张晖.大米蛋白的提取及改性研究[D].无锡:江南大学, 2008

[10]奚海燕,张晖,姚惠源.碱酶分步法从米粉中提取大米蛋白工艺的研究[J].粮油食品科技,2007,15(6):12-14

[11]吴欣欣,玉米蛋白酶解物抗氧化活性研究[D].郑州:河南工业大学,2013

[12]李绮丽,吴卫国,张喻,等双酶法水解米渣蛋白工艺研究[J].粮食与油脂,2011(1):19-22

Component Analysis of Corn Starch Cake and Enzymatic Extraction of Protein Optimization Technology

ZUO Ying1，ZHANG Ping1，CAO Xue-dan2，ZHANG Hui1，ZHANG Xin-hua3
（1.Department of Biotechnology and Pharmaceutical Technology of Ningxia Polytechnic，Yinchuan 750021，Ningxia，China；2.Institute of Citrus，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Taizhou 318020，Zhejiang，China；3.Aksu Prefecture Agricultural Technology Promotion Center，Aksu 843000，Xinjiang，China）

Using enzymatic hydrolysis of the Corn starch cake in the protein as the research object and optimizing process conditions of the enzymatic protein extraction，the results showed that the protein content of corn starch cake in the highest 33.1 g/100 g，especially glutamic acid and leucine amino acid content was higher，which conform to basic requirements of being developed into a seasoning or food additives；proteins were extracted by different enzymes hydrolysis corn stach cake.The results showed that the highest extraction rate of 29.02%alkaline protease；Using single factor analysis combined with the optimization of separation technology of protein sugar dregs in orthogonal experiment；results for the extraction temperature 45℃，pH 11.5，1%of the amount of enzyme，the material liquid ratio 1∶11，extraction time 3 h，extraction rate can reach 39.77%.The protein amino acid composition analysis showed Glutamic acid，leucine content than the sugar content in slag increased most，up to 8.332 and 6.089 respectively，it the value of development and utilization and potential.

corn starch cake；enzymatic；extract protein

2014-07-07

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.023

宁夏职业技术学院重点课题支持项目“催化玉米淀粉糖渣水解的酶品种的筛选研究”（XJ201202）；宁夏职业技术学院设施园艺无土栽培技术创新中心（培育）项目支持

左莹（1981—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：植物加工利用。