金银花中绿原酸的超声波提取工艺优化

黄小梅，邓祥，吴狄

（1.四川文理学院化学与化学工程系，四川达州635000；2.四川文理学院"特色植物开发研究"四川省高校重点实验室，四川达州635000）

金银花中绿原酸的超声波提取工艺优化

黄小梅1，2，邓祥1，2，吴狄1，2

（1.四川文理学院化学与化学工程系，四川达州635000；2.四川文理学院"特色植物开发研究"四川省高校重点实验室，四川达州635000）

研究从金银花中提取绿原酸的工艺。通过研究乙醇浓度、温度、料液比、超声时间、超声功率等因素对提取效率的影响。在运用超声波法下得出绿原酸提取工艺的最佳工艺参数：乙醇浓度为70%，浸提温度为55℃，料液比为1∶20（g/mL），超声时间为1.5 h，超声功率为700 W。在此条件下采用紫外分光光度法（UV）对绿原酸产品进行检测，在328 nm波长下，得到绿原酸的最大峰值，计算得率为7.887%。

金银花；绿原酸；提取工艺；正交试验；超声法

金银花为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或带初开的花[1]，具有很高的药用价值，为常用抗菌消炎和清热解毒中药材[2]。其化学成分为绿原酸（chlorogenic acid，简称CHA）、异绿原酸、挥发油、咖啡酸、黄酮类化合物、三萜皂苷和木犀草素等。其中绿原酸是金银花的主要药效活性成分之一[3]，其含量高低是评价金银花质量的重要依据。

绿原酸具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压及兴奋中枢神经系统等多种药理作用。因而可作为食品中的添加剂、植物生长激素及一些高级化妆品的添加剂等。绿原酸是食品、药品、化妆品等工业的重要原料[4-5]。因此，开发绿原酸市场前景广阔、发展潜力巨大。

金银花原产我国，分布各省。现代生药学研究资料表明，药用植物种类的变异和生长环境因子是影响生药品质的重要因素，中药作用的物质基础是其所含有的化学成分[6]，为探讨川产道地金银花的品质，全面评价其药材质量。本文以川产道地金银花为原料，采用UV法对金银花中CHA的含量进行测定，以乙醇为提取溶剂，研究了金银花中绿原酸的超声波提取工艺，确定出最佳提取条件，以期为金银花中绿原酸的提取提供参考。

1 仪器、试剂与样品

1.1 仪器

UV-2550型紫外可见分光光度计：日本岛津；FA1104N型电子天平：上海菁海；FW-135型中草药粉碎机：上海超亿；TG20-WS型离心机：郑州宏朗；HN-1000D型超声波萃取仪：上海汗诺；101-2AB型电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特；60目的筛子。

1.2 试剂与样品

金银花：四川达县金佛中药材种植有限公司；绿原酸对照品：阿拉丁；无水乙醇为分析纯：成都科龙；实验用水为二次蒸馏水。

2 方法与实验

2.1 方法学考察

2.1.1 对照品溶液的制备

准确称取绿原酸标准品5.0 mg，用适量70%乙醇充分溶解，转移至50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，摇匀做对照品储备试液。此试液中绿原酸的浓度为100 μg/mL。

2.1.2 测定波长的选择

将对照品绿原酸溶液和供试品溶液在200 nm～400 nm进行扫描，其均在328 nm波长处有最大吸收，故检测波长选为328 nm。

2.1.3 标准曲线的绘制

分别精确移取绿原酸对照品溶液0、1、2、4、6、8、10 mL于7个25 mL容量瓶中，然后用70%乙醇定容至刻度，摇匀，静置。以第1管作空白对照，在最大吸收波长328 nm处测定吸光度，以绿原酸的浓度（mg/mL）为横坐标，以吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线[7]，如图1，得到标准曲线方程为：Y=60.788X+0.002 1，r= 0.999 9，绿原酸浓度在4 μg/mL～40 μg/mL内线性关系良好。

图1 绿原酸标准曲线Fig.1 Standard curve of chlorogenic acid

2.1.4 精密度实验

准确称取金银花粉末0.250 0 g，按2.2项方法操作，重复测定5次，其吸光度分别为1.521 6、1.521 8、 1.521 5、1.521 9、1.522 1，RSD为0.02%。

2.1.5 重复性实验

准确称取金银花粉末5份，各为0.250 0 g，按2.2项方法操作，其吸光度分别为1.492 1、1.493 8、1.491 4、1.489 6、1.489 0，RSD为0.44%。

2.1.6 回收率实验

准确称取已知含量的金银花粉末0.250 0 g 5份，加入不同量的绿原酸对照品，按按2.2项方法操作测定加样回收率，依法重复测定3次，平均回收率为98.95%，RSD为1.17%。

2.1.7 稳定性实验

准确称取金银花粉末适量，按2.2项方法操作，每隔2小时测定1次，结果样品溶液在14 h内稳定，RSD为1.44%。

2.2 样品中绿原酸的提取及测定

将金银花于35℃的干燥箱恒温干燥24 h后，冷却至室温，然后用粉碎机粉碎（过60目筛）。准确称取0.250 0 g金银花粉末于离心管中，加入适量的70%乙醇进行超声提取，将提取液离心，并取上层清液于25 mL容量瓶中，重复多次，用70%乙醇定容至刻度，再精取其1 mL于25 mL容量瓶中，定容至刻度。按2.1的方法测定其吸光度，根据回归方程计算提取液浓度，进一步计算绿原酸提取量。改变不同提取条件，考察乙醇质量分数、提取温度、提取时间、提取功率和提取料液比对提取量的影响。

提取量（以绿原酸计，mg/g）=（C×V）/M

式中：C为样液中绿原酸的含量，（mg/mL）；V为样液的体积，mL；M为样品质量，g。

3 结果与讨论

3.1 单因素超声提取优化实验讨论

高中力学在现代科学技术上发挥了重要作用，并且在社会各技术领域的实践中得到了广泛应用和发展。在各项科学技术不断发展的时代潮流中，高中力学融合各领域技术，促进了人类社会的历史性进步。随着科学技术更深入的发展，很多人们没有涉足的领域也将会有人类的痕迹。高中力学在这些领域同样会发挥其巨大的科技价值，为人类造福。

3.1.1 乙醇浓度对绿原酸提取效果的影响

适宜的溶剂浓度会有利于有效成分的溶解，可缩短提取时间，增加提取效率。准确称取7份金银花粉末各0.250 0 g于离心管中，分别加入质量分数为30%、40%、50%、60%、70%、80%、100%的乙醇溶液8 mL，在45℃和超声功率为1000W的情况下超声浸提2.0h，离心，取上层清液按2.1.3的方法测定绿原酸的浓度。从而得到绿原酸提取效果与乙醇浓度的关系。结果如图2所示。

由图2结果可知，在乙醇质量分量为30%～70%之间，绿原酸的提取量随乙醇浓度增大而增大，并在70%时达到最大值，之后随乙醇浓度的增大提取量反而减少。根据相似相容原理，可能是由于乙醇浓度增大，醇溶性物质竞争溶解，导致了绿原酸的溶解度下降。因此，在乙醇质量分数为70%时，绿原酸的提取效果最好。

3.1.2 提取温度对绿原酸提取效果的影响

准确称取0.250 0 g金银花粉末于离心管中，分别加入8 mL 70%的乙醇溶液，分别在25、35、45、50、55、65℃的条件下，在1 000 W的超声功率下超声2.0 h，离心，取上层清液，测定绿原酸浓度，计算提取量，从而确定较适宜的提取温度，结果如图3所示。

图2 乙醇浓度对绿原酸提取效果的影响Fig.2 Effect of alcohol concentration on the yield of chlorogenic acid

图3 超声温度对绿原酸提取效果的影响Fig.3 Effects of temperature on extraction rate of chlorogenic acid

由图3结果可知，温度过低不利于绿原酸的浸出，提取量较低，较高的提取温度能促进分子的热运动，使溶剂和溶质分子之间的交换速度加快，这样更有利于增加绿原酸的浸出，从而增加了提取量。但是绿原酸是热敏性物质，过高的温度会使绿原酸分解而被破坏，导致提取量降低。因此最佳的提取温度为50℃。

3.1.3 料液比对绿原酸提取效果的影响

以质量分数为70%的乙醇为溶剂，准确称取0.250 0 g金银花粉末，分别以不同总料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL的条件下，并在50℃和1 000 W的超声功率下提取2.0 h，测定金银花中绿原酸的含量，从而确定不同料液比和提取量的关系，结果如图4所示。

图4 液料比对绿原酸提取效果的影响Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on extraction rate of chlorogenic acid

由图4结果可知，料液比较小时，绿原酸提取不充分，随着乙醇用量的不断增加，绿原酸有效成分的提取量也在不断增加，但乙醇溶液用量过大其他组分溶解反而不利于绿原酸的提取。从图4可知当料液比为1∶20（g/mL）时提取效果最好。

3.1.4 超声时间对绿原酸提取效果的影响

准确称取0.250 0 g金银花粉末于离心管中，分别加入5 mL 70%的乙醇溶液，并在50℃和1 000 W的超声功率下分别超声0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h。离心，取上层清液，测定绿原酸浓度，计算提取量，从而以确定最佳提取时间，结果如图5所示。

图5 超声时间对绿原酸提取效果的影响Fig.5 Effects of extracting time on extraction rate of chlorogenic acid

由图5的结果可知，随着提取时间的增加，提取量不断增加，在1.5 h时绿原酸提取量达到最大值，之后再增加提取时间并没有得到较高的提取量。提取时间短绿原酸不能充分溶解出来，时间过长，其他组分被提取出来，可能影响提取效果，因此最佳提取时间为1.5 h。

3.1.5 超声功率对绿原酸提取效果的影响

准确称取0.250 0 g金银花粉末于离心管中，分别加入5 mL 70%的乙醇溶液，并在50℃和1.5 h的条件下分别以300、500、700、900、1 100 W的超声功率进行操作。离心，提取上层清液，测定绿原酸浓度，计算提取量。从而确定适宜的超声功率，如图6所示。

由图6可知，随着超声功率的增加，其绿原酸的提取量不断增加，但到700 W处后提取量趋于稳定。再增加功率对绿原酸的提取量影响不大。从经济的角度考虑其最佳的提取功率取700 W为宜，其提取效率为7.64%，提取量为76.4 mg/g。

图6 超声功率对提取效果的影响Fig.6 Effects of ultrasonic power on extraction rate of chlorogenic acid

3.2 超声提取金银花中绿原酸的正交试验讨论

在绿原酸的提取过程中，乙醇浓度、提取温度、料液比、超声时间、超声功率等因素都影响绿原酸的得率。根据绿原酸的结构和性质以及传统提取经验，选用超声功率700 W情况下，对其余4个因素进行正交试验，L9（34）即三水平四因素模式。其中4个因素分别为超声时间（A）、提取温度（B）、料液比（C）和乙醇浓度（D）。以绿原酸得率为指标，进行正交试验，其因素水平及正交实验结果分别见表1、表2。

表1 正交试验设计因素水平Table1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交试验结果Table 2Results of orthogonal test

由表2可以看出，极差R4>R1>R3>R2，得到各因素影响提取量的主次顺序为D>A>C>B，即乙醇浓度、超声时间、料液比，其次是温度。所以乙醇浓度是影响金银花中绿原酸提取量的主要因素。由正交试验k值可知，最优组合为A2B3C2D2。即超声时间为1.5 h，提取温度为55℃，料液比为1∶20（g/mL），乙醇浓度为70%。3.3结果验证分析

在最优组合A2B3C2D2条件下，做3次平行实验，考察金银花中绿原酸提取率的最优水平条件，其结果见表3所示。

表3 最优组合条件下的结果验证Table 3Results of the best extraction conditions

由表3结果可知，在最优组合条件下，通过3组平行试验验证，可得金银花中绿原酸的平均提取率为7.887%。

4 结论

以川产道地中药材金银花为原料和乙醇水溶液为溶剂，利用正交试验对提取工艺进行优化参考，通过大量的单因素水平实验，以绿原酸得率为指标，考察了超声波提取金银花中绿原酸的不同条件对提取效果的影响，获得的最佳提取条件为：乙醇浓度为70%，浸提温度为55℃，料液比为1∶20（g/mL），超声时间为1.5 h，超声功率为700 W，其绿原酸得率为7.887%。

本工艺操作简便，提取条件温和，提取效率高，同时乙醇成本低，可回收利用，环保经济。因此此法可为金银花中提取绿原酸的工业化生产提供参考。

[1]国家药典委员会.中华人名共和国药典(2005版第一部)[S].北京:化学工业出版社,2005:152-153

[2]邢俊波,李会军,李萍,等.忍冬花蕾化学成分研究[J].中国新药杂志,2002,11(11):856-859

[3]孙延波,王云,关显智,等.金银花对口腔病原性微生物体外抑菌试验的研究[J].中国中药杂志,1996,16(5):5

[4]王辉,田呈瑞,马守磊,等.绿原酸的研究进展[J].食品工业科技, 2009,30(5):341-345

[5]吴江涛.绿原酸的生物活性及其应用[J].现代农业科技,2009, 19(8):349-350

[6]邢俊波,李萍,温德良.不同物候期金银花中总绿原酸的积累动态研究[J].中国中药杂志,2001,26(7):457-459

[7]邓祥,黄小梅,吴狄.川佛手中总黄酮的超声波提取工艺优化[J].四川文理学院学报,2014,5(24):37-40

Process Optimization of Ultrasonic Extraction of Chlorogenic Acid in Honeysuckle Flower

HUANG Xiao-mei1，2，DENG Xiang1，2，WU Di1，2
（1.Department of Chemistry and Chemical Engineering，Sichuan University of Arts and Science，Dazhou 635000，Sichuan，China；2.Key Laboratory of the Research on Characteristic Plants of Universities in Sichuan Province，Sichuan University of Arts and Science，Dazhou 635000，Sichuan，China）

Extraction of chlorogenic acid from Honeysuckle Flower was studied systematically.The ultrasonic method assisted extraction of chlorogenic acid，the effect of factors was investigated and the optimal parameters were determined as follows：the concentration of ethanol was 70%，leaching temperature was 55℃，the ratio of Honeysuckle Flower to ethanol was 1∶20（g/mL），time was 1.5 h，ultrasonic power was 700 W.The use of UV spectrophotometry for detection of chlorogenic acid products.In the 328 nm wavelength，obtained the maximum peak of chlorogenic acid，was 7.887%calculated.

Honeysuckle Flower；chlorogenic acid；extraction process；orthogonal experiment；ultrasonic method

2013-08-21

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.010

四川省教育厅重点项目资助（11ZA169;13ZA0101）；达州市科技局重点项目资助（JCYJ1119）

黄小梅（1977—），女（汉），副教授，硕士，主要研究方向：天然产物化学。