明日叶查尔酮对急性辐射损伤小鼠氧化损伤的作用研究

翟苗苗，刘庆平，张常春，钟进义

(青岛大学医学院公共卫生学院，山东青岛 266021)

明日叶(Angelica keiskei Koidzumi)是一种野生芹科植物，今天摘叶明日就能发新幼芽，因此取名为明日叶［1］。明日叶的主要效应成分为查尔酮(chalcone AC)，研究发现其具有抗氧化、抗癌等作用且毒性非常低，因此吸引了很多科学家研究此活性与作用。研究证实明日叶查尔酮具有清除氧自由基作用，而氧化损伤是辐射对机体损伤的重要机制之一，在国内外对其抗辐射作用却鲜有研究，因此本实验通过测定小鼠肝组织总抗氧化能力(T－AOC)，脂质过氧化物(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)含量的变化和细胞增殖与细胞凋亡活性的高低，来证实AC对急性辐射损伤后机体抗氧化能力的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物

清洁级健康昆明种小鼠50只，雌雄各半，体重22～25g，由山东鲁抗医药实验中心提供，在本实验室适应性喂养1周后进行实验。

1.2 主要仪器与试剂

主要仪器:美国Varian公司生产的2100 C型6 MV直线加速器X射线源;Q－911全自动放免仪，中国科技大学实业总公司;XDS－1B型倒置显微镜、DP72型图像采集设备，日本OLMPUS公司。

主要试剂:总抗氧化能力(T－AOC)、脂质过氧化物(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)等制备的肝组织，采用南京建成生物工程研究所提供的检测试剂盒进行检测;Bcl－2一抗、二抗和即用型SABC免疫组化试剂盒均购自于武汉博士德生物工程有限公司。

2 实验方法

2.1 动物分组与处理

将50只昆明种小鼠随机分为正常对照组、辐射损伤组、明日叶查尔酮(AC)低、中、高剂量组共5组，每组10只，雌雄各半。低、中、高剂量组每日经口灌胃给予剂量为4、20、40 mg/(kg·bw)/d明日叶查尔酮，正常对照组与辐射损伤组给予生理盐水，连续5 d。在第6天实验动物进行X射线一次性全身照射，照射距离为1.1 m，辐射剂量为4 Gy，正常对照组不照射。各组小鼠均按前述方法分别给予明日叶查尔酮和生理盐水5天，第6天脱臼处死，取组织待检。

2.2 检测指标

2.2.1 肝组织 T－AOC，MDA，SOD 活性测定

取肝脏称重。肝组织切碎，冰浴下匀浆，3500 r/min离心5min，T－AOC检测采用菲啉比色法，MDA检测采用硫代巴比妥比色法，SOD检测采用黄嘌呤氧化酶法，取上清检测。

2.2.2 肝组织Bcl－2蛋白表达水平的检测

免疫组化法测定，取肝脏经固定、脱水、透明处理、包埋后制成组织切片，将切片进行脱蜡和水化、灭活内源性酶、热修复和封闭处理后滴加一抗和二抗，DAB显色，再经苏木素复染，在高倍镜视野(×400)下观和拍照，用Image－Pro Plus图像分析软件进行光密度分析。

统计学处理采用SPSS17.0统计软件，计量资料做单因素方差分析，以 p＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

(1)各组小鼠肝脏组织总抗氧化能力T－AOC、脂质过氧化物MDA含量和超氧化物歧化酶SOD活性检测结果:与正常对照组相比较，辐射损伤组T－AOC、SOD 出现显著性降低(p＜0.05)，MDA 含量显著性增高(p＜0.05)，高剂量组较辐射损伤组TAOC、SOD 出现显著性升高(p＜0.05)，MDA 含量显著性降低(p＜0.05)。结果见表1。

表1 明日叶查尔酮对小鼠X射线照射后T－AOC、MDA和SOD含量的影响()

表1 明日叶查尔酮对小鼠X射线照射后T－AOC、MDA和SOD含量的影响()

注:a与正常对照组相比较p＜0.05;b与高剂量组相比较，p＜0.05。

T－AOC MDA SOD正常对照组别3.901 ±0.304 1.864 ±0.324 71.938 ±1.0513.91 ±1.045 1.467 ±0.364 72.061 ±1.045辐射损伤 1.429 ±0.308ab 3.751 ±0.432ab 34.665 ±1.178ab低剂量组 2.399 ±0.504 3.246 ±0.378 37.886 ±1.26中剂量组 3.793 ±0.279 2.309 ±0.375 62.056 ±1.638高剂量组

(2)各组小鼠肝脏Bcl－2蛋白水平测定结果:与辐射损伤组比较，高剂量组的Bcl－2阳性表达的细胞多、染色深，呈强表达;Bax则阳性表达的细胞少、染色浅，呈弱表达，图像分析结果显示，高剂量组Bcl－2为 76.975 ±1.847，较辐射损伤组显著性升高(p＜0.05)。见表2。

表2 明日叶查尔酮对小鼠X射线照射后肝组织Bcl－2蛋白的影响()

表2 明日叶查尔酮对小鼠X射线照射后肝组织Bcl－2蛋白的影响()

注:a与正常对照组相比较p＜0.05;b与高剂量AC组相比较p＜0.05。

Bcl－2正常对照组别n 10 76.975 ±1.84710 82.361 ±1.958辐射损伤 10 56.383 ±2.282ab低剂量组 10 60.723 ±1.672b中剂量组 10 67.096 ±1.588高剂量组

4 讨论

电离辐射反应产生大量自由基，使DNA、生物膜、蛋白质等生物大分子结构改变、功能异常甚至丧失，从而产生辐射损伤效应［2］。生物体本身存在有一系列如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等清除自由基的抗氧化酶，它们可以清除过多的H2O2、O－2，有效低·OH［3］，从而减轻自由基对机体的损伤。

机体总抗氧化能力(T－AOC)取决于机体内的抗氧化剂，其主要是通过抑制或清除自由基，提高内源性抗氧化物质水平来拮抗大量自由基对机体生物大分子的损害，在维持体内氧化和抗氧化系统平衡中发挥重要的作用。本实验结果显示与正常对照组相比，辐射损伤组总抗氧化能力显著性降低，三个剂量组较辐射损伤组均较辐射损伤组升高，并且存在剂量反应关系，高剂量组与辐射损伤组有显著性差异，可以说明AC可以提高机体辐射损伤后的抗氧化能力。

MDA是反映机体脂质过氧化程度的指标［4］，其含量的变化可间接反映组织中自由基含量的变化。SOD反应机体自由基水平和氧化应激水平，其活力的高低可间接反映机体清除自由基的能力［5］。本实验结果显示与正常对照组相比，辐射损伤组MDA含量显著增加，SOD活性均明显降低 提示辐射增强脂质过氧化作用，破坏了抗氧化酶系统，与辐射损伤组相比，高剂量组与辐射损伤组的差异有统计学意义，提示明日叶查尔酮对X射线引起的肝组织氧化损伤有一定的防护作用。

Bcl－2基因是人体最主要的抗凋亡基因。现有研究已证明bcl－2基因可抑制各种刺激下多种细胞的凋亡。大量有关AC抗肿瘤的研究已表明，有些天然或人工合成的含羟基、甲氧基、氮基、硼酸基和卤基等的查尔酮具有细胞毒性作用，能抑制恶性肿瘤细胞增殖，诱导其凋亡，下调Bcl－2蛋白的表达［6］。而对正常细胞却无毒和致突变作用，能拮抗细胞损伤，保护细胞正常的分化增殖，上调Bcl－2蛋白的表达。本实验结果显示，与辐射损伤组相较，随AC含量的增高，Bcl－2蛋白含量增加，高剂量AC组与辐射损伤差异有统计学意义，提示AC使肝细胞凋亡水平降低，进而提高肝细胞的DNA损伤修复能力和辐射耐受性。

总之，通过本实验的研究综合得出，明日叶查尔酮对小鼠急性辐射损伤有一定的防护措施，具有增强小鼠抗氧化能力，提高细胞增殖与降低细胞的凋亡率的作用，具体机制还有待于进一步研究探索。

［1］廖头根，汪秋安，方伟玲，等.新型查尔酮类化合物的合成及其生物活性研究［J］.有机化学;2006，26(5)，685－689.

［2］侯军峰，焦凯，张盈华.中药复方对X线照射小鼠T淋巴细胞亚群和抗氧化能力的作用［J］.中国免疫学杂志;2003，19(1):54－56.

［3］夏寿萱.放射生物学［M］.北京:军事医学科学出版社，1998:37－42.

［4］陈海刚，马胜伟，林钦，等.氯化三丁基锡对黑鲷鳃和肝组织SOD、MDA 和 GPx的影响［J］.南方水产，2009，5(2):23－27.

［5］马征，黄凰，张莹莹，等.白藜芦醇对辐射损伤的保护作用［J］.中南大学学报，2013，38(6):597－601.

［6］陈建忠.查尔酮类化合物的抗肿瘤活性及其构效关系研究进展［J］.中国药房，2014，25(5):467－470.