高效石油降解菌的筛选及在石油污水处理中的应用

黄敏刚 付瑞敏 谷亚楠 郭彦钊 陈五岭

摘要：分别从新疆油田、大庆油田的原油中分离得到高效石油降解菌2株，分别编号L-1和D-2，对菌株进行形态学、生理生化及分子生物学分析，而后将L-1和D-2等比例形成微生物复合菌剂，测定复合菌剂对不同浓度和不同性质原油的降解率，并将该复合菌剂初步应用于石油污水的处理中。经鉴定，这两株菌分别为多食鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium multivorum）和动胶菌（Zoogloea oryzae）。复合菌剂的最适接种量为9%、最适处理时间为72 h、最适pH 7.5，在该条件下，可将污水的含油量降低85%。因此，这两株高效石油降解菌在石油污水的处理中具有巨大的应用潜力。

关键词：石油降解菌；原油；石油污水；水处理

中图分类号：Q93-331；X741 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）13-3104-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.13.009

Screening on Highly Efficient Oil-degrading Bacteria and Their Application

in Oil Sewage Disposal

HUANG Min-gang1， FU Rui-min1，2， GU Ya-nan1， GUO Yan-zhao1， CHEN Wu-ling1

（1.College of Life Science， Northwest University， Xi'an 710069， China； 2.Henan Institute of Education， Zhengzhou 450046， China）

Abstract： Two strains（L-1，D-2），which can degrade petroleum， were isolated from crude oil of Xinjiang oilfield and Daqing oilfield respectively. After the morphological， physiological， biochemical and molecular analysis， the two strains were identified and mixed together in equal proportion to form the microbial agents. Then， the microbial degradation rates of crude oil with different concentration and properties were tested. After that， the microbial agents were preliminarily applied to crude oil sewage disposal. As was shown in the results， the strains（L-1，D-2）were identified as Sphingobacterium multivorum and zoogloea oryzae respectively. The optimal inoculating concentration of the microbial agents was 9%， the optimal processing time was 6 h， and optimal pH was 7.5.Under that condition， the removal rate of crude oil could reach 85%. Therefore， the two oil-degrading bacterium were considered to have great utilization potentials on oil sewage disposal.

Key words：oil-degrading bacteria； crude oil； oil sewage； water disposal

石油是由多种烃类组成的复杂混合物，含有少量硫、氮、氧等化学元素和微量金属[1]。石油中的烃类化合物包括从甲烷到相对分子质量1 500～2 000的烃类，主要包括烷烃、环烷烃及芳香烃，约占石油含量的50%～80%，其中烷烃是石油中的主要成分，碳原子数在1～40不等，其中以6～8个碳原子数的烷烃在石油中含量较高。目前，油井产物中的含水量远大于含油量，油田综合含水率达90%以上[2]。石油污水的超标排放对水体环境和自然生态环境造成严重危害。石油污水中石油的存在形态分为4种：浮油、分散油、乳化油、溶解油。其中，浮油和分散油可以静置一段时间从石油污水中分离出来，乳化油和溶解油可以稳定分散于石油污水中，采用一般方法很难去除[3，4]。利用微生物分布广、繁殖快以及可以彻底降解污染物和不产生二次污染来处理石油污水被视为一项应用前景广阔的石油污水处理技术[5]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 原油样品分别取自新疆油田和大庆油田的原油，原油的性质见表1。

1.1.2 培养基 富集培养基：NaCl 10 g，NH4Cl 1.5 g，K2HP04 0.5 g，MgS04 0.5 g，CaCl2 0.2 g，KCl 0.1 g，FeS04·7H20 0.02 g，5 mL表面活性剂，去离子水1 000 mL，pH 7.0；

分离和斜面保存培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂20～30 g，灭菌过的原油1%，去离子水1 000 mL，pH 7.0～7.2；

液体发酵培养基：NaCl 10 g，NH4Cl 1.5 g，K2HP04 0.5 g，MgS04 0.5 g，CaCl2 0.02 g，KCl 0.1 g，FeS04·7H20 0.02 g，去离子水1 000 mL，pH 7.0，灭菌过的原油酌情添加。

1.1.3 石油污水 石油污水取自某油田某采油厂，水质如表2。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离与筛选 分别将新疆油田和大庆油田灭菌过的10 g原油样品加入到200 mL的富集培养基中，温度35 ℃、150 r/min的摇床中培养7 d，通过稀释涂平板法筛选分离出石油降解菌[6]。从大庆油田分离得到的菌株编号为D-1～D-6，从新疆油田分离得到的菌株编号为L-1～L-7。

将分离得到的菌株制成菌悬液，取1 mL菌悬液接种到100 mL含石油浓度为4 g/L的液体发酵培养基中，在摇床上培养，转速为150 r/min，温度35 ℃，培养5 d之后采用GC分析法[7]测定培养液中的原油残余量，每个处理3个重复，对照组为不接菌的原油浓度为4 g/L的液体发酵培养基，计算其平均降解率，筛选出高效降解菌株。

将筛选出的高效石油降解菌在LB平板上交叉划线，检验菌株间是否存在拮抗作用。

1.2.2 菌株形态观察及生理生化反应 将筛选所确定的菌株，在LB平板上划线，32 ℃分别培养24 h，革兰氏染色观察菌株的个体形态，观察菌落形态，生理生化反应[8]。

1.2.3 菌株的分子生物学鉴定 参照前人方法[9]，采用上海生工提供的试剂盒提取所选菌株的DNA和回收其16S rDNA片段。16S rDNA的PCR扩增引物采用通用引物（27F：5′-AGAGTTGTCATGGCTC-3′和1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′），该引物合成自上海生工。PCR反应参数（94 ℃，5 min； 94 ℃，50 s→50 ℃，50 s→72 ℃，90 s，共计30个循环；72 ℃，10 min）。由上海生工将所得PCR产物回收纯化并对目的片段进行基因测序，所得序列采用MEGA3.0同NCBI上的相近物种的16S rDNA序列构建系统发育树，树的聚类稳定性进行1 000次自导检验[10]。

1.2.4 石油降解菌对原油的降解试验

1）不同含油量对降解效果的影响。原油降解试验中液体发酵培养基和原油样品分开灭菌，改变液体发酵培养基中石油的添加量，使浓度分别为1、2、4、6、8、10 g/L，菌剂接种量为5%，每个处理3个重复，进行石油降解实验，转速为150 r/min，温度35 ℃，培养5、10、15 d后分别取样，分别采用GC分析法进行残余石油烃含量的分析及降解率的测定。

降解率=（m1-m2）/m1×100%，式中，m1为原油添加量，m2为原油残余量。

2）原油性质对降解效果的影响。原油降解试验中液体发酵培养基和原油样品分开灭菌，原油浓度为4 g/L液体发酵培养基，混合菌剂接种量为5%，分为4个处理，每个处理3个重复，分别为处理1（新疆原油+混合菌剂）、处理2（大庆原油+混合菌剂），大庆原油和新疆原油的处理组分别作为对照，转速为150 r/min，温度35 ℃，培养15 d后，采用GC分析法进行残余石油烃含量及降解率的测定。

1.2.5 复合菌剂对石油污水的处理试验 石油污水取自某油田采油厂，复合菌剂由L-1和D-2菌株以1∶1的比例组成，将复合菌剂接种到1 000 mL的石油污水中，选择温度为35 ℃、转速为150 r/min恒温摇床培养，选择复合菌剂的接种量、污水处理时间、石油污水的初始pH作为3个因素，选用L16（43）正交表，设计3因素4水平试验，以石油污水的原油降解率为试验指标，确定最佳水处理试验条件。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选和分类鉴定结果

从新疆油田和大庆油田的原油样品中分别分离得到7和6株原油降解菌，编号为L-1～L-7和D-1～D-6，其中有一株酵母菌，其余都是细菌，对每株菌进行原油降解试验，发现L-1和D-2的降解效率最高。每株石油降解菌的降解效果如表3。

通过L-1和D-2菌株在LB培养基上交叉划线，从平板中两株菌交叉点的生长状况来看，L-1和D-2菌株互相没有拮抗作用，可以混合使用。

参照文献[8]的步骤对L-1和D-2菌株作了初步鉴定：L-1和D-2菌株为革兰氏阴性菌，短杆状，无芽孢，L-1菌株在LB固体培养基上初期为黄色之后变为珊瑚红色，菌落圆形，不透明，有光泽，D-2菌株在LB固体培养基上菌落白色、圆形、透明。

将菌株L-1和D-2的16S rDNA片段进行PCR扩增，得到大约1 500 bp的两个片段，其扩增结果如图1所示，将所得PCR产物提交公司测序，得到分别得到1 491 bp和1 482 bp的序列，将该序列和NCBI数据库中的各近缘菌株的16S rDNA序列进行比对，应用Bioedit 7.0进行多重比较，分析其同源性，并构建系统发育树（图2），经分析，菌株L-1的序列和Sphingobacterium multivorum IAM 14316（Accession No.NR_040953）显示了99%的同源性，菌株D-2的序列和Zoogloea oryzae A-7（Accession No. AB201043）显示了97%的同源性，根据其系统进化特征，可确定菌株L-1为多食鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium multivorum）和菌株D-2为动胶菌（Zoogloea oryzae）：

2.2 混合菌剂对原油的降解试验结果

2.2.1 不同原油浓度对降解效果的影响 考虑到单个菌株对原油的降解率有限，而原油成分又较为复杂，本试验采用混合菌剂对原油进行降解。将筛选出的高效石油烃降解菌L-1和D-2以1∶1的比例进行复配制成复合菌剂，以5%的接种量将其接入不同原油浓度的液体发酵培养基中，在不同处理时间下，其原油降解结果如图3所示，图3显示，随着原油浓度和处理时间的变化，混合菌剂对原油的降解率遵循不同的规律，当处理时间为5 d，混合菌剂对原油的降解率随着原油浓度的增加逐渐降低，其范围在12.4%～32.3%。当处理时间为10～15 d时，混合菌剂对原油的降解率在原油浓度低于4 g/L时，随着原油浓度增加而逐步升高，当原油浓度高于4 g/L时，降解率随着原油浓度的增加而逐步降低，当原油浓度为4 g/L时，混合菌剂对原油的降解率达到最大，这说明了原油浓度对原油的降解率有较大的影响，高浓度原油抑制了微生物的生长，而且原油浓度过大会造成降解体系中其他营养元素的相对缺乏，例如微生物生长所必须的氮、磷的相对缺乏，从而降低了微生物对原油的降解率。同时混合菌剂的作用时间对原油降解率也有影响，随着混合菌剂处理时间的延长，原油的降解率相对增加。当混合菌剂的处理时间为5 d时，原油浓度为1 g/L的处理结果最佳；当混合菌剂的处理时间为10 d和15 d时，原油浓度为4 g/L的原油降解率最高。分析其原因可能是接种混合菌剂初期，由于其不适应新的生长环境，高浓度的含油量会抑制其生长繁殖，从而影响了原油的降解率.当处理时间大于10 d，即微生物适应了环境，进入了对数生长期，在一定范围内（原油浓度小于4 g/L），其原油降解率就会随原油浓度的增加而增加。

2.2.2 不同性质原油对降解效果的影响 相同条件下，微生物对稀油和重油的去除效果不同，其结果遵循对稀油的降解率大于对重油的降解率的规律[11]；即使是同一种原油，微生物对其不同组分也有着不同的降解率，对各组分的降解率从高到低依次为烷烃﹥芳香烃﹥胶质和沥青，其中各个组分含量不同，会影响原油的生物可降解性[12]。混合菌剂对稀油和重油总烃及烷烃、芳香烃和胶质沥青的去除结果如图4所示，结果显示对于总烃的降解率，微生物混合菌剂对稀油的作用效果大于重油，但是对于胶质沥青的降解率，微生物复合菌剂对重油的作用效果大于稀油，分析其原因可能是由于油中胶质和沥青的含量远高于稀油。从图4还可以看出，微生物复合菌剂对原油不同组分其降解率有所不同，这是由于微生物的代谢机制不同，故而对原油各组分的降解效果不同。因此，将微生物应用于石油污染治理中，不仅应该考虑多菌株的混合使用，还应该考虑菌株对芳香烃及胶质和沥青综合降解效果。

2.3 复合菌剂对石油污水处理效果的影响

复合菌剂对石油污水的处理采用L16（43）设计正交试验[13]，试验方案和试验结果如表4所示，表4中R3﹥R1﹥R2，所以影响石油污水处理结果的试验因素的主次顺序为处理时间，初始pH，接种量。

从表4可以看出，初始pH 7.5、接种量12%、处理时间96 h为理论上最理想的处理方式，但是从节约资源、减少成本和缩短试验周期方面考虑，最佳的试验方案为pH 7.5、接种量9%、处理时间为72 h。

3 结论与讨论

本试验从原油样品中分离筛选出2株高效石油降解菌，通过分析菌株的个体和群体形态、生理生化反应以及分子鉴定，最终确定这2株菌分别为多食鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium multivorum）和菌胶团菌（Zoogloea oryzae）。考察L-1和D-2菌株石油降解能力，降解率分别达到46.5%和42.5%。所选菌株比其他研究筛选得到菌株[14，15]降解效率高、周期短。

所得两株菌株以1∶1的比例进行复配制成复合菌剂，测定复合菌剂对不同处理时间、不同原油浓度和不同原油组分的原油降解率，结果显示，处理时间、原油浓度和原油组分含量均会影响复合菌剂对原油的降解率，其中，当液体发酵培养基中原油浓度达到4 g/L时，原油的降解率最高；混合菌剂对稀油的降解效果要明显优于重油。

复合菌剂应用于石油污水的处理，对其影响条件进行3因素4水平的正交试验，结果显示，当复合菌剂的接种量为9%时，石油污水的初始pH 7.5，处理时间为72 h，石油污水的处理效果最佳。

长期以来人们关注石油污染并进行了相关研究，已经取得了一定的成果[16]，但是石油降解菌的分离筛选都是从石油污染的土壤或者石油污水中。本试验从原油中分离得到高效原油降解菌，将高效原油降解菌等比例复配组成复合菌剂应用于石油污水处理的初步试验，取得了较好的结果，证明应用石油降解菌处理石油污水具有很大的应用潜力。本研究发现微生物对石油组分中芳香烃及胶质和沥青的降解率较低，下一步应该着眼于芳香烃及胶质和沥青的降解菌的筛选或培育。本研究所筛选的高效石油降解菌来源于油田的原油样品，可以进一步尝试应用于高浓度石油污染土壤的修复，为石油污染的土壤修复提供参考。

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