波纹巴非蛤小分子肽在水剂化妆品中的稳定性

陈得科 陈忻 陈华 潘剑宇 陈晓刚 刘少余 孙恢礼

摘要：试验考察了含量、空气暴露时长、光照、pH、化妆品常用防腐剂等因素对波纹巴非蛤（Paphia Undulate）小分子肽抗氧化活性的影响，并研究了其在化妆品体系中的稳定性。结果表明，波纹巴非蛤小分子肽在含量为0.2%～1.0%（m/V）时对自由基的清除能力随含量增大而增强，当含量达到1.0%时，羟自由基清除率为66%，超氧阴离子自由基清除率为70%，且24 h空气暴露对自由基清除能力无影响；波纹巴非蛤小分子肽的光和pH稳定性良好；常用化妆品防腐剂对其稳定性基本无影响，但避免加入量过大。波纹巴非蛤小分子肽作为抗氧化活性物质适于与大部分水剂化妆品原料进行配伍。

关键词：波纹巴非蛤（Paphia undulate）小分子肽；化妆品；稳定性；自由基；抗氧化

中图分类号：TQ658.2+5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）13-3208-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.13.036

Stability of Paphia Undulate Small-Molecule Peptides in the Aqueous Cosmetics

CHEN De-ke1，2，CHEN Xin3，CHEN Hua1，PAN Jian-yu1，CHEN Xiao-gang3，LIU Shao-yu3，SUN Hui-li1

（1.South China Sea Institute of Oceanology， Chinese Academy of Sciences/Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology， Guangzhou 510301， China； 2.University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China； 3.Department of Chemistry and Chemical Engineering， Foshan College of Science and Technology， Foshan 528000， Guangdong， China）

Abstract： The influence of content， exposed time， light， pH and cosmetic preservative on the Paphia undulate small-molecule peptides（SMP） antioxidative activity were investigated，and its stability in cosmetic system was studied. The results showed that the free radical scavenging rate increased with SMPs content at 0.2%～1.0%，at the content of 1.0%， hydroxyl free radical scavenging rate was 66%，and the ultra oxygen anion free radical rate was 70%，and it was stable after 24 hours air，light exposing and pH or mixing with cosmetic preservatives. Thus，P. undulate SMP was stable and suiltable ingredient for most aqueous cosmetics.

Key words： Paphia undulate small molecular peptides； cosmetics； stability； free radical； antioxidation

现代医学理论与技术的飞速发展给化妆品行业开拓了全新的发展方向，化妆品类型已从洁肤、润肤为目的的基础产品转向延缓衰老、美化肤色为目的的功效型护肤品，并逐步朝着生物美容的目标迈进[1]。护肤、延缓衰老类化妆品是当今化妆品开发的主题。近年来，随着海洋生物活性物质研究的深入和开发利用技术的提高，海洋生物中具有抗氧化功效的活性物质不断被发现，并被应用于功能性化妆品、功能性食品、营养食品和医药品等[2，3]。

自由基引起人体衰老直观表现为产生皱纹和白斑，过多的自由基能与皮肤组织中的不饱和脂肪作用产生脂质过氧化物，形成脂褐素沉积在皮肤上，出现色斑及老年斑[4]。羟自由基（·OH）可直接损伤细胞各种生物膜，导致机体功能失常[5]；超氧阴离子自由基（·O2-）能攻击生物大分子，引起细胞结构和功能的破坏，造成人体的衰老[6]，这两种自由基的清除率常被作为判断受试物是否具备抗氧化活性的重要指标。海洋生物活性肽具有良好的抗自由基氧化功能，太平洋鳕鱼酶解肽与人工合成抗氧化剂BHT的抗氧化能力相当[7]，从海洋轮虫、海蜇和贻贝中提取到的小分子肽都具有显著的清除自由基活性[8-10]，在创伤皮肤修复、抗衰老和抗氧化的皮肤护理产品中起到重要作用[11-13]，可作为功效成分添加到化妆品中。波纹巴非蛤（Paphia undulate）又名花甲螺，是中国南方近海养殖规模最大的海产贝类之一[14]，其含有的活性物质具有显著的抗氧化和抗疲劳活性[15，16]。以波纹巴非蛤为原料酶解得到的小分子肽进行延缓衰老活性的试验表明，其对D-半乳糖急性致衰老的大鼠具有延缓皮肤衰老的作用[17]。同时波纹巴非蛤小分子肽还可以给予含有胶原蛋白质的皮肤层所必需的养分，使皮肤中的胶原蛋白质活性加强，保持角质层水分以及纤维结构的完整性，改善皮肤细胞生存环境和促进皮肤组织的新陈代谢，增加肌肤循环，有滋润皮肤延缓老化、美白、祛皱、嫩肤的作用[18]。

抗氧化活性作为小分子肽的重要活性，其活性是否减弱是其稳定性的重要指标。因此为考察波纹巴非蛤酶解小分子肽在常用化妆品配方体系中的稳定性，本试验研究了含量、空气暴露时间、光照、酸碱度、常用化妆品防腐剂等因素对波纹巴非蛤小分子肽羟自由基和超氧阴离子清除率的影响，从而为波纹巴非蛤小分子肽在化妆品中的应用研发提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

原料与试剂：波纹巴非蛤小分子肽（相对分子质量≤3 000 u），由中国科学院南海海洋研究所海洋生物高值利用与绿色技术实验室提供；邻二氮菲、邻苯三酚购自佛山安洋化玻仪器有限公司；PBS、焦性没食子酸购自天津市福晨化学试剂厂；H2O2、FeSO4购自广州市东红化工厂；HCl、柠檬酸、氢氧化钠购自广州化学试剂厂；乙醇、甘油、丙二醇购自广州市仕贤化工有限公司；卡松购自济南市历城区骞越化工经营部；试剂均为分析纯级。

主要仪器：紫外分光光度计L-6S，上海精密科学仪器有限公司；美国Cole-Parmer紫外灯箱WX-97621-40，15W，上海上碧实验仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 羟自由基清除率 采用邻二氮菲-Fe2+氧化法[19]测定。在1 mL 0.75 mmol/L邻二氮菲溶液中依次加入2 mL PBS和不同浓度的样品液1 mL，充分混合后，加入1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液与1 mL 0.01% H2O2，于37 ℃下温育60 min，于536 nm处测其吸光度AB；同时以去离子水为空白对照，测定吸光度A0，并测定不加样品加H2O2溶液的吸光度Ap。小分子肽对·OH的清除率（D）的计算公式为：

D=■×100% （1）

1.2.2 超氧阴离子自由基清除率 采用邻苯三酚自氧化法[20]测定。取4.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液，置于20 ℃水浴中预热20 min，分别加入1 mL试样和0.4 mL 25 mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25 ℃水浴中反应5 min，加入1 mL 10 mmol/L HCl终止反应，420 nm处测定吸光度Ai，空白对照组以相同体积的蒸馏水代替样品，并测定吸光度A0。小分子肽对·O2-的清除率（P）计算公式为：

P=■×100% （2）

1.3 理化因子对波纹巴非蛤小分子肽抗氧化活性的影响试验

1.3.1 含量及空气暴露时间对波纹巴非蛤小分子肽抗氧化活性的影响试验 配制含量为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%（m/V，g∶mL下同）的波纹巴非蛤小分子肽溶液，室温放置0、2、8、24 h后，测量 ·OH清除率和·O2-清除率。

1.3.2 光照对波纹巴非蛤小分子肽抗氧化活性的影响试验 将1.0%波纹巴非蛤小分子肽溶液避光、室内和紫外灯照射下分别放置 0、2、8、24 h后，测量·OH清除率和·O2-清除率。

1.3.3 pH对波纹巴非蛤小分子肽抗氧化活性的影响 将1.0%的波纹巴非蛤小分子肽溶液pH用柠檬酸和氢氧化钠分别调节为4、5、6、7、8，分别放置0、2、8、24 h后，测量·OH清除率和·O2-清除率。

1.3.4 乙醇对波纹巴非蛤小分子肽抗氧化活性的影响试验 分别配制含1.0%波纹巴非蛤小分子肽与2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%乙醇的混合溶液，用柠檬酸调节pH至7，室温放置0、2、8、24 h后，测量·OH清除率和·O2-清除率。

1.3.5 卡松对波纹巴非蛤小分子肽抗氧化活性的影响试验 卡松主要活性成分为两种异噻唑啉酮类化合物，化学名称分别为5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮，在化妆品防腐方面已有广泛应用，其作用机理是抑制微生物蛋白质合成，具有毒力低、易降解、安全、高效的特点[21]。分别配制1.0%波纹巴非蛤小分子肽与0.05%、0.10%、0.20%、0.50%、1.00%卡松的混合溶液，用柠檬酸调节pH至7，室温放置0、2、8、24 h后，测量 ·OH清除率和·O2-清除率。

1.4 化妆水对波纹巴非蛤小分子肽稳定性的影响试验

1.4.1 化妆水配方 自制添加波纹巴非蛤小分子肽化妆水配方，如表1所示。

1.4.2 化妆水的制备工艺 ①配制醇相。在室温下将化妆品常用防腐剂加至95%乙醇中，搅拌溶解；②配制水相。分别加入甘油、丙二醇、柠檬酸、氢氧化钠、波纹巴非蛤小分子肽等继续搅拌至均匀；③混合配制。快速搅拌下将醇相缓慢加入到水相中至均质，过滤即可。

1.4.3 化妆水中波纹巴非蛤小分子肽稳定性测定

配制含1.0%波纹巴非蛤小分子肽的化妆水于室内室温放置0、2、8、24 h后，测量·OH清除率和·O2-清除率。

2 结果与分析

2.1 化妆品基础环境对波纹巴非蛤小分子肽抗氧化活性的影响结果

2.1.1 含量及空气暴露时间 配制含量为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%波纹巴非蛤小分子肽水溶液并暴露于室温空气中，测定不同时间节点小分子肽溶液对·OH及·O2-的清除率，结果如图1所示。由图1可知，波纹巴非蛤小分子肽对自由基有较好的清除作用，其清除效果与肽的含量呈明显的量效关系，且自由基清除率在24 h空气暴露时间内无变化，表明小分子肽在溶液状态也较为稳定。当小分子肽含量为0.2%～0.8%时，·OH和·O2-的清除率随着小分子肽含量的增大而增加，当小分子肽含量为0.8%和1.0%时，·OH清除率为63%和66%，·O2-清除率为67%和70%，自由基清除率增加趋势明显减缓。这与海蜇小分子肽的羟自由基清除率和菲律宾蛤仔寡肽的超氧阴离子自由基清除率相当，当海蜇小分子肽浓度为15 mg/mL时，羟基清除率为最大值62.27%[9]；菲律宾蛤仔寡肽在浓度为2.0 mg/mL时，超氧阴离子自由基清除率为74.26%[22]。

2.1.2 光照 将含量为1.0%波纹巴非蛤小分子肽水溶液分别进行避光、室内、紫外光照射处理，监测各溶液在不同处理时间小分子肽溶液对·OH和·O2-的清除率，结果如表2所示。由表2可知，波纹巴非蛤小分子肽在24 h内避光、室内和紫外光照射条件下自由基清除率无明显变化，表明小分子肽的光稳定性良好。但建议在小分子肽及其相关产品的贮存和销售过程中应尽量避免紫外光直射，最好采用不透明的包装材料进行包装，避免长时间光照对化妆品体系产生影响。

2.1.3 pH 有报道指出，抗氧化肽在碱性条件下会消耗部分能够产生清除自由基效果的氢供体上的氢，从而导致活性下降，也有可能是该环境下抗氧化肽发生消旋作用而致[23]；在酸性条件下抗氧化性则基本不受影响；中性溶液中肽的抗氧化活性最强，pH为1～8时肽的活性保持率为90%左右[24]。由表3可知，波纹巴非蛤小分子肽在pH为4～8的环境下其自由基清除能力无明显变化，常用化妆品pH为4～8，因此波纹巴非蛤小分子肽适用于大部分化妆品。

2.2 化妆品常用防腐剂对波纹巴非蛤小分子肽抗氧化活性的影响

2.2.1 乙醇 乙醇作为防腐剂已有很长历史，其安全性高且能有效抑制菌类繁殖，有保持水分、防止产品硬化的效果，但当乙醇含量超过4%时，产品中有乙醇的味道溢出[25]。由表4可知，波纹巴非蛤小分子肽在2%～10%的乙醇溶液中，自由基清除能力在24 h内基本无变化，不受乙醇体积分数的影响，表明波纹巴非蛤小分子肽在乙醇环境下的自由基清除能力较为稳定，在产品配方中乙醇体积分数应保持在较小比例。

2.2.2 卡松 卡松是化妆品企业生产洗发香波最常用的防腐剂，在所调查的近百家化妆品企业中，有20.6%的化妆品使用了卡松作为防腐剂[26]，其特点是用量少、安全、低毒，对皮肤无刺激、无过敏，是一类高效广谱杀菌剂，在化妆品中使用含量范围为0.000 5%～2.000 0%。由表5可知，添加不同含量的卡松后，小分子肽自由基清除率随时间无明显变化，说明作为常用化妆品防腐剂的卡松对波纹巴非蛤小分子肽的自由基清除能力基本无影响。

2.3 化妆水对波纹巴非蛤小分子肽稳定性的影响结果

2.3.1 化妆水对波纹巴非蛤小分子肽稳定性的影响 在常用化妆水配方中加入1%的波纹巴非蛤小分子肽，监测该化妆水对·OH和·O2-自由基的清除率，结果如表6所示。由表6可知，波纹巴非蛤小分子肽在常用化妆水配方环境下与相同含量条件下的小分子肽水溶液清除自由基的能力相当，表明在化妆水环境下的波纹巴非蛤小分子肽抗氧化活性不受影响。

2.3.2 化妆水稳定性测验结果 根据中华人民共和国轻工行业标准QB/T 2660-2004对所制含1%小分子肽的化妆水进行感官、理化性质测试，结果如表7所示。由表7可知，化妆水颜色、浑浊度、耐寒耐热试验及酸碱度的检测结果均符合中华人民共和国轻工行业标准QB/T 2660-2004化妆水的感官、理化指标规定，表明添加小分子肽对普通化妆水的质量指标基本无影响。

3 结论

通过对波纹巴非蛤小分子肽在化妆品应用过程中重要影响因素进行考察表明，波纹巴非蛤小分子肽清除自由基的能力随其含量增加而增强，含量在0.2%～0.8%范围内抗氧化性增强趋势明显，在0.8%～1.0%时抗氧化性增加趋势减缓；小分子肽具有较好的光稳定性；在pH 4～8范围内小分子肽抗氧化活性稳定；化妆品常用防腐剂乙醇和卡松对小分子肽抗氧化活性无明显影响。综上所述，波纹巴非蛤小分子肽作为化妆品活性成分，适合与大部分化妆品作配伍，其抗氧化活性在大部分化妆品配方及保存环境中都相对稳定。

参考文献：

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[6] 魏连会.酱油中水溶性肽的提纯及抗氧化活性研究[D]. 黑龙江裴德：黑龙江八一农垦大学，2013.