一株细菌对蔬菜病原真菌抑菌活性的研究

马淑玲 孙新城 王富 张玲丽 张浩

摘要：采用菌丝生长速率法测定分离自实验室的一株细菌对黄瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）的抑菌效果。结果表明，这株细菌对以上3种病原菌均有较好的抑制效果，其中对黄瓜灰霉病菌的抑制效果最好；细菌粗发酵液经一定强度的温度和酸碱处理后仍有一定的抑菌效果，抑菌效果在pH 5.1～9.0之间无显著差异；用胰蛋白酶处理后拮抗活性无明显变化；经硫酸铵处理过的粗发酵液，其上清液与沉淀均具有抑菌活性。

关键词：粗发酵液； 黄瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）； 辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）；黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）； 抑菌活性

中图分类号：S436.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）10-2377-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.018

植物病害每年给农业生产造成了巨大的损害，化学农药的使用虽可有效地防治各种病害，但是大量连续使用化学农药会引起严重的环境污染和食品安全问题，进而为害人类的健康和生存质量[1]。同时迫于农业无公害、绿色、有机生产的迫切需要以及农产品出口农药残留等方面的限制要求，使研究和开发环境友好的生物农药进行生物防治成为目前世界农药发展的趋势[2]。植物病害生物防治的防治因子包括微生物、抗生素等多种因素。具有生防潜力的微生物有细菌、真菌、放线菌和病毒等种类。这些微生物可通过与病原菌竞争生态位和营养物质、分泌抗菌物质、寄生病原菌等多種生防机制实现对植物病害的防治[3]。灰霉病是农作物的主要病害之一，如何高效安全地进行灰霉病的防治是长期以来有待解决的难题。筛选对灰霉病菌有拮抗作用的微生物，从中开发出新型、高效、无毒天然农用杀菌剂是防治灰霉病的重要途径。安瑞平[4]采用组织分离法，从黄瓜各器官（根、茎、叶）中得到内生细菌173株。通过平板对峙培养筛选出8株对黄瓜灰霉病菌具有较强拮抗作用的细菌，再对这8株菌发酵滤液的抑菌活性进行测定，选出抑菌效果最好的2个菌株B12和B13，抑制率分别为84.0%和81.8%[4]。张兴锋等[5]分离了红树植物（木榄）体内的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CⅢ-1菌株，对多种病原菌具有较强的抑制作用，该菌产生的抗菌蛋白液对疫霉菌等植物病原菌具有较强的拮抗作用，同时发现该抗菌蛋白对热不稳定。

本研究针对目前对黄瓜灰霉病、辣椒疫霉病、黄瓜枯萎病尚无高效生防菌株的问题，采用生长速率法测定细菌MSL2#对以上3种病原菌是否具有生防效果。同时研究了经不同温度和酸碱处理后，MSL2#菌发酵液对这三种蔬菜病原菌抑菌活性的变化，以期得到具有高效生防潜力的菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 黄瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf），细菌MSL2#（拮抗菌，待鉴定）均由郑州轻工业学院实验室分离提供。

1.1.2 培养基 PDA培养基：马铃薯200 g、琼脂15 g、葡萄糖20 g、去离子水1 000 mL。用于病原真菌的活化及培养。牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.5 g、蛋白胨1 g、氯化钠0.5 g、琼脂2 g、去离子水1 000 mL。用于生防细菌的活化及培养。

1.2 方法

1.2.1 细菌活化 用接种环从试管中挑取MSL2#，接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，37 ℃培养3～4 d。

1.2.2 发酵液的制备 取在斜面中活化好的MSL2#，注入2 mL无菌水，配成菌悬液，摇匀后用移液器各移取1 mL接种至装有150 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，于37 ℃摇床培养3 d。

将发酵好的发酵液于高速冷冻离心机中12 000 r/min离心10 min，收集上清液于250 mL无菌三角瓶中，细菌过滤器对离心上清液进行过滤，收集滤液于250 mL无菌三角瓶中，即为粗发酵液，置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.3 对病原真菌拮抗效果的测定 MSL2#对黄瓜灰霉病、辣椒疫霉病、黄瓜枯萎病3种病原真菌拮抗效果的测定采用抑制菌生长速率法，重复3次，用直径为0.6 cm的打孔器在培养好的供试菌落边缘切下菌饼，用接种环反接于培养皿内，28 ℃培养4～5 d，用十字交叉法测量菌落扩展直径，每个处理重复3次，计算抑菌率[6]。

1.2.4 热处理对粗发酵液活性成分的影响 取5支10 mL灭过菌的离心管，分别加入5 mL粗发酵液，然后将这5支离心管分别于40、50、60、80、100 ℃水浴锅内处理15 min，采用抑制菌丝生长速率法以黄瓜灰霉病菌为指示菌进行拮抗效果测定，每个温度处理设3个重复，同时设3个未加粗发酵液的对照；28 ℃恒温培养，2、3、4、5、6 d后测量菌落扩展直径，并计算抑制率[2]。

1.2.5 pH变化对拮抗菌粗发酵液拮抗活性的影响 取6支10 mL灭过菌的离心管，分别加入5 mL粗发酵液，用0.025 mol/LNa2CO3溶液和0.05 mol/L柠檬酸溶液分别将离心管中的粗发酵液调pH为9.0、7.0、6.1、5.1、4.4、3.8，处理24 h后，再调回发酵液最初pH。采用抑制菌丝生长速率法进行拮抗效果测定，每个pH处理设3个重复，同时设3个未加粗发酵液的对照；28 ℃恒温培养4 d后测量菌落扩展直径，并计算抑制率。

1.2.6 酶处理对粗发酵液活性的影响 取3支10 mL灭过菌的离心管，加入5 mL粗发酵液，分别称取胰蛋白酶5、10、15 mg置于5 mL粗发酵液中，将上述离心管于37 ℃水浴1 h，以黄瓜灰霉病菌为指示菌进行拮抗活性测定。

1.2.7 硫酸铵对发酵液中蛋白质的沉淀研究 用不同浓度的硫酸铵（0、0.5、1.0、2.0、4.0 mol/L）对MSL2#的粗发酵液进行沉淀离心后分别收集上清液，测定处理后的上清液对黄瓜灰霉病菌的拮抗试验。

2 结果与分析

2.1 MSL2#的粗发酵液对三种蔬菜病原菌的抑制效果

MSL2#对黄瓜灰霉病菌、辣椒疫病菌、黄瓜枯萎病菌均有一定的抑制效果（图1），抑制率均随着培养天数的增加而上升，第6天开始有下降的趋势。其中，发酵液对黄瓜灰霉病菌的抑制率最高为80.4%，而对辣椒疫病病原菌、黄瓜枯萎病菌的最高抑制率分别为62.7%、52.3%。说明这株MSL2#的发酵液对黄瓜灰霉病菌的抑制效果最好。

2.2 pH变化对活性成分的影响

不同酸碱处理后的细菌发酵液上清液对黄瓜灰霉病菌抑制效果见图2，结果表明，pH 3.8～9.0处理后的发酵液随着培养天数的增多，对黄瓜灰霉病菌的抑菌效果也不断增加，6 d后，抑菌率达到最高。pH 5.1～9.0范围内对黄瓜灰霉病菌的抑制效果没有显著性差异，可见这株拮抗细菌发酵产物的抑菌活性物质可以耐受较宽的酸碱范围。

2.3 热处理对粗发酵液的影响

MSL2#的发酵液通过不同温度和不同时间的处理，以黄瓜灰霉病菌来检测热处理后的发酵液的抑制效果（图3），结果表明，不同温度处理后发酵液的抑菌活性存在显著性差异，经过40、50、60 ℃处理15 min的发酵液对黄瓜灰霉病菌抑制率最高分别达50%、38%、18%，100 ℃处理15 min后抑制率降低至5%以下，综上可知MSL2#的粗发酵液具有一定的耐热性。

2.4 酶处理对活性成分的影响

由图4可知，经酶处理的MSL2#粗发酵液随着胰蛋白酶浓度的增大，其对黄瓜灰霉病菌的抑制率变化不显著，表明MSL2#的拮抗物质能抵抗胰蛋白酶的降解。

2.5 硫酸铵对发酵液中蛋白质的沉淀结果

用不同浓度的硫酸铵对MSL2#的粗发酵液进行处理，测定处理后的上清液对黄瓜灰霉病菌的抑制率，结果见图5。由图5可知，经过不同终浓度的硫酸铵处理过的发酵液对黄瓜灰霉病菌均有一定的抑制效果，随着硫酸铵终浓度的增加，抑菌率则逐渐减小，说明上清液的活性成分主要是蛋白质，同时也可能含有非蛋白组分。

3 小结与讨论

有研究曾对蔬菜病害进行过生防菌的筛选并有一定的抑菌效果，但是这些菌株存在一定的不足，如抗菌蛋白对热不稳定等[4，5，7]。本试验结果表明，MSL2#的粗发酵液对黄瓜灰霉病病菌、辣椒疫病病原菌、黄瓜枯萎病菌均有一定的抑制效果，其中对黄瓜灰霉病菌的抑制效果最好，菌株的发酵液对热和酸碱都比较稳定， 抑菌活性物质能抵抗一定浓度的胰蛋白酶，以上结果均说明MSL2#具有较好的生防潜力。

本研究仅是对菌株进行了初步发酵，该菌对黄瓜灰霉病的抑菌效果可达80%，但对辣椒疫病病原菌和黄瓜枯萎病菌的抑制率分别为62.7%、52.3%。將来随着发酵条件和发酵工艺的发展，代谢物质的产量将会进一步提高，抑菌活性也会进一步提高，为该菌的进一步转化奠定基础。

同时硫酸铵沉淀后的发酵液上清液和沉淀均有一定的拮抗活性，说明发酵液活性物质主要是蛋白质，也有非蛋白组分，其粗发酵液中拮抗物质的活性成分的分离提纯以及具体性质及大田防治效果等都将有待于进一步的深入研究。

参考文献：

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[2] 张万里，乔润香，尹 飞，等.13种植物提取物对5种果蔬病原真菌的抑菌活性[J].华南农业大学学报，2009，30（2）：40-43.

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[4] 安瑞平.黄瓜内生细菌的分离及拮抗菌株的筛选初报[J].安徽农学通报，2009，15（16）：39-40，75.

[5] 张兴锋，柳 凤，何 红，等.红树内生细菌CⅢ-1菌株鉴定及其胞外抗菌蛋白性质[J].微生物学通报，2010，37（2）：222-227.

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