多菌灵降解菌的鉴定及降解条件初步优化

徐惠娟　胡典典　张虹

摘要：对已分离到的多菌灵降解菌进行16S rDNA序列分析后，采用均匀设计法，优化多菌灵降解菌降解条件。用4因素6水平混合均匀设计表，综合考察培养时间、接种量、pH、温度对多菌灵降解菌降解能力的影响。通过二次多项式逐步回归得出最终降解条件为：培养时间6 d、接种量10%、pH 4.0、温度为45 ℃时，最优目标函数Y（降解率）为68.65%。进一步进行盆栽试验，检测该菌在实际应用中的降解效率为59.54%。

关键词：多菌灵降解菌；均匀设计；降解条件优化；盆栽试验

中图分类号：Q939.9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）10-2372-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.016

多菌灵是一种高效广谱低毒的内吸性杀菌剂，广泛应用于工业和农业生产，主要用于水果保鲜、蔬菜、果树和谷类作物的真菌病害防治[1]。多菌灵化学性质稳定且降解半衰期长，在果蔬及土壤中的残留能对生态环境和人、畜健康造成极大危害[2]。利用生物降解法去除多菌灵残留已成为热点。本研究运用均匀试验设计的方法，多因素多水平地优化多菌灵降解菌对多菌灵的降解条件，评估降解菌的降解能力，为实现多菌灵残留去除的生物修复提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

试验菌株从长期喷洒多菌灵的花卉基质土中分离纯化得到，保存于实验室内。

1.2 试剂与培养基

多菌灵标准品由Adamas公司生产，纯度为98%，80%多菌灵悬浮剂为苏州遍净植保科技有限公司生产。

种子培养基参考文献[3]，降解培养基为NaCl 100 mg，K2HPO4 150 mg，KH2PO4 50 mg，MgSO4·7H2O 20 mg，（NH4）2SO4 200 mg，多菌灵20 mg，去离子水 100 mL。pH依需要调节。

1.3 菌株鉴定

将菌株充分活化后进行菌体形态观察和革兰氏染色。提取细菌基因组DNA，PCR扩增16S rDNA，PCR产物纯化后送上海生工生物工程有限公司测序，测序数据在NCBI上进行BLAST比对分析。

1.4 均匀设计及数据分析

选用均匀设计试验方案，拟选4因素，即培养时间（X1）、接种量（X2）、pH（X3）、温度（X4）（图1），每个处理重复5次，测定不同因素条件下多菌灵降解菌对多菌灵的降解能力，采用DPS数据处理系统分析所得数据，对多菌灵降解率进行优化求解，建立菌株对多菌灵的最佳降解力模型，预测最佳值。

1.5 盆栽试验

1.5.1 小白菜的预处理 种植7盆小白菜，其中试验组3盆，对照组4盆。按市售多菌灵使用说明配制多菌灵悬浮剂，将所配药剂等份均匀喷洒到试验组与对照组的小白菜茎及叶表面，早晚各处理一次，每次每盆20 mL。连续处理2 d，第3天开始用生长于对数期的菌液处理小白菜，每盆菌液20 mL，对照不喷菌。喷菌后第3、5、7天采样进行多菌灵残留测定。

1.5.2 标准曲线的绘制与样品的提取分离 参考于彦彬等[4]测量多菌灵残留量的方法，进行标准曲线的绘制和样品多菌灵残留量测定。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定

在牛肉膏蛋白胨平板培养基上进行菌株djj-1活化培养24 h后观察，菌落较小，奶白色，表面光滑，湿润，呈圆形。显微镜下观察菌体为杆状，单个存在或成对存在，静止期呈球形，革兰氏染色为革兰氏阴性菌。

将菌株djj-1的16S rDNA序列在NCBI上进行序列比对分析和同源性比较，发现其与Acinetobacter baumannii的同源性达99%。

2.2 降解菌的降解条件优化

采用三波长校正法对均匀设计的每个试验处理进行多菌灵降解率的测定，结果见图1。

采用偏最小二乘回归法（Partial Least Squares，PLS）[5]，以培养时间（X1）、接种量（X2）、pH（X3）、温度（X4）为自变量；以降解率（Y）为因变量建立回归方程如下：

Y=56.298 4-1.150 6X1-7.162 0X2+1.567 2X3-0.055 1X4-0.416 1X12+0.202 8X22+0.005 1X33- 0.003 7X44+0.5352 7X1X2+0.238 4X1X3+0.002 7X1X4-0.243 6X2X3+0.156 4X2X4-0.056 0X3X4

回归方程Y的决定系数R2为0.865 3，经F检验P<0.01，表明回归方程的拟合程度较好。

为了寻求在试验条件下获得最大降解率，通过DPS数据处理系统对回归方程Y进行优化求解，得到各个试验因素的最优组合：X1为6，X2为10，X3为4，X4为45，即培养时间为6 d、接种量为10%、pH 4.0、温度45 ℃时，最优目标函数Y（降解率）为68.65%。

2.3 多菌灵降解菌株的初步应用分析

2.3.1 标准曲线 参照多菌灵标准曲线[4，6]的测定步骤， 测定不同含量多菌灵的三波长校正吸光度ΔA， 以校正吸光度ΔA为纵坐标，多菌灵的含量为横坐标，绘制标准曲线。在0～50 μg浓度范围内，曲线的回归方程为Y= 0.001 5-0.000 8X（μg），Y为校正吸光度ΔA，相关系数为0.999 5。

2.3.2 样品的测定结果 对处理后的小白菜进行多菌灵残留量的测定，根据数据计算得最大降解率为59.54%（表2），在理想最优目标函数（降解率）68.65%以内。

3 小结与讨论

微生物法是消除环境中多菌灵农药污染的有效手段，因此，选育和应用高效多菌灵降解菌是多菌灵环境污染实现高效处理的重要措施。本研究将多菌灵降解菌经多次分离纯化后，对其进行16S rDNA序列分析，發现与Acinetobacter baumannii的同源性达99%。

菌株对多菌灵的降解容易受到多种因素的限制，包括多菌灵的浓度、培养时间、pH、温度及金属离子等。目前对多菌灵降解菌的研究多局限在实验室试验单因素水平降解率方面，本研究应用均匀试验设计方法，从多因素、多水平研究微生物降解多菌灵的能力，优化菌株djj-1对多菌灵的降解条件。结果表明，在其最优条件下，即培养时间6 d、接种量为10%、pH 4.0、温度45 ℃时，降解率为68.65%。

本试验采用分光光度法进行了小白菜中多菌灵残留量的测定。结果表明，多菌灵菌株对小白菜中多菌灵最大降解率为59.54%，其结果较为满意，但本试验只是研究了菌株对盆栽小白菜多菌灵的降解作用，实验室中的温度相对适中，昼夜温差不大，无阳光暴晒等环境因素的影响。如果将降解菌在户外蔬菜田中应用，对多菌灵的降解能力如何尚有待进一步研究。

参考文献：

[1] 冯 坚.英汉农药名称对照[M].北京：化学工业出版社，2003.

[2] GARCIA P C， RUIZ J M， RIVERO R M， et al. Is the application of carbendazim harmful to healthy plants evidence of weak phytotoxicity in tobacco[J]. J Agric Food Chem，2002，50（2）：279-283.

[3] 沈 萍.微生物学实验[M].第四版.北京：高等教育出版社，2007.

[4] 于彦彬，苗在京，万述伟，等.三波长校正光度法测定水果蔬菜中多菌灵残留量[J].理化检验（化学分册），2005（5）：353-357.

[5] 蒋卫红，夏结来.偏最小二乘回归及其应用[J].第四军医大学学报，2003，21（3）：2802-2831.

[6] 范宁云，蔡 兴，李彩霞.分光光度法测定蔬菜中多菌灵残留量新方法的研究[J].甘肃科技，2009，25（2）：52-53.