黄芩提取物对常见致病菌的体内外抑菌活性测定

崔一喆，耿仁德，王秋菊，朱双，王新，孙蕊

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319；2.黑龙江省农垦建三江分局勤得利农场第六管理区）

黄芩为唇形科植物黄芩的干燥根，在我国药用历史悠久，迄今已有2 000 多年的历史。黄芩中主要的黄酮类成分为黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素，黄芩苷和汉黄芩苷及其代谢物是黄芩发挥药用功效的物质基础[1-2]。黄芩抗菌范围较广，其中对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的抑制作用最强，且对钩端螺旋体也有一定的抑制作用。黄芩煎剂、水浸出液对甲型流感病毒PR8 株以及亚洲甲型均有抑制作用。国内学者在探讨多种中药对产β-内酰胺酶大肠埃希菌的敏感性研究中，认为黄芩抑菌效果最好[3]。研究采用体外抑菌试验确定黄芩提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌浓度，以小鼠为试验对象，灌注致病菌感染后，再灌注黄芩提取物，确定黄芩提取物的体内抑菌活性，为其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

昆明纯种小白鼠，6～8 周龄雄鼠，体重18～23 g，购于本院实验动物中心。金黄色葡萄球菌（CMCC26003），大肠杆菌（CMCC44102）、沙门氏菌（CMCC（B）50094）标准菌株由黑龙江八一农垦大学动物科技学院预防兽医学教研室馈赠。

1.2 药品和试剂

黄芩水煎剂：将生药常规煎煮3 次，取滤液浓缩成1 kg·L-1药液。灭菌的酵母粉水溶液，用于稀释肠内容物。

1.3 培养基

伊红美兰培养基用于鉴别大肠杆菌，在营养肉汤培养基中加入高浓度的盐水，用于鉴别金黄色葡萄球菌；采用沙门氏菌显色培养基鉴别沙门氏菌。以上培养基均购自青岛海博生物有限公司。

1.4 方法

1.4.1 菌种活化

采用常规方法进行细菌活化，用平板培养计数法将菌液稀释至浊度为1×107CFU·mL-1，4 ℃冰箱保存备用。

1.4.2 体外抑菌试验

采用试管二倍稀释法测定黄芩提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的最小抑菌浓度（MIC）。取灭菌试管10 支，编号，于各管中各加入无菌肉汤培养基2 mL，然后于第1 管中加入受试药液2 mL，混匀后取出2 mL 加入第2 管中，以此类推，直到第9 管中取出2 mL 弃去；第10 管为肉汤对照，只加入2 mL 营养肉汤，不加药液；然后各管加入稀释到2×106CFU·mL-1的菌液0.1 mL，摇匀，置37 ℃恒温箱中培养18 h 观察结果，以不发生浑浊显现的最高稀释倍数为该药物的MIC 值。

1.4.3 体内抑菌试验

小鼠随机分为6 组，每组20 只，共120 只。3 组给药组，小鼠分别灌注金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌，菌液浓度为1×107CFU·mL-1，每只小鼠灌胃0.2 mL，连续3 天，然后再灌胃1 g·mL-1黄芩水煎剂，0.2 mL·d-1，连续4 d；3 组对照组，小鼠分别灌注3 种致病菌3 d 后，灌胃与药液相同体积的生理盐水4 d。同时观察7 d 内小鼠死亡情况。

1.4.4 标本的采集与培养

各致病菌灌注3 d 后和黄芩灌注4 d 后，分别从各组取5 只小鼠，无菌称取十二指肠、空肠、回肠和盲肠，并将同组小鼠的相同小肠内容物混合均匀，各取0.1 g 于EP 管中，以10 倍稀释成系列稀释浓度。用微量移液器取各样品的各稀释度100 μL 接种伊红美兰培养基、高盐培养基和沙门氏菌显色培养基的琼脂平板上，涂布均匀，于37 ℃需氧培养24 h，观察并记录菌落数CFU·g-1。计算公式：CFU·g-1=x·47×稀释倍数。结果以每g 内容物中菌数的对数表示（log CFU·g-1）[4]。

1.5 数据处理

两组间均数的比较采用t 检验，用SPSS16.1 软件统计分析P＜0.05 为差异显著，P＜0.01 为差异极显著。

2 结果

2.1 黄芩对3 种致病菌的体外抑菌性测定

试验结果见表1。从表1 中可知黄芩对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌均有抑菌活性，其中对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最强，MIC 值为0.031 g·mL-1，对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌活性次之，MIC 值均为0.063 g·mL-1。

表1 黄芩提取物体外抑菌效果（MIC）Table 1 Antibacterial effects of scutellaria baicalensis in vivo（MIC）

2.2 各组小鼠死亡率测定

各组小鼠死亡数量和死亡率结果如表2 所示，给药组与对照组相比，死亡率明显降低。各组小鼠在灌注金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的3 d中，自第2 d 开始有小鼠死亡，3 d 结束时各组死亡小鼠数量为2～3 只，死亡率为20%～30%；第4 d 开始，给药组灌注黄芩提取物，对照组灌注相同剂量的生理盐水，结果显示给药各组的小鼠在大肠杆菌和沙门氏菌致病组有1 只死亡，而金黄色葡萄球菌致病组没有死亡小鼠。整个试验期来看，各致病菌灌注后小鼠死亡数量没有太大差异，而后期灌注黄芩提取物与灌注生理盐水相比，可以显著降低各组小鼠的死亡率。沙门氏菌致病后灌药小鼠死亡率降低最多，达35%；大肠杆菌灌胃小鼠死亡率降低次之，为26.1%；金黄色葡萄球菌灌胃小鼠死亡率降低最少，为15%。但就灌菌后与灌水组相比，黄芩灌胃使金黄色葡萄球菌和沙门氏菌致病组小鼠的死亡数量由2只降为0 和由3 只降为1，显著降低这两组小鼠的死亡率。而灌药后大肠杆菌致病组的小鼠死亡数量减少1 只，与灌水组死亡数量的2 只相比，死亡数量减少50%，也有显著抑菌作用。

表2 各组小鼠死亡数量Table 2 Animal death rate of antibacterial test in mice

2.3 黄芩对3 种致病菌的体内抑菌性测定

给药组和对照组小鼠十二指肠、空肠、回肠和盲肠中3 种致病菌菌数结果见表3。由表3 可见，与各对照组相比，各给药组的各段小肠中各致病菌数量均有降低，且大肠杆菌和沙门氏菌的数量在给药后显著降低（P＜0.05），而金黄色葡萄球菌数量在给药后极显著降低（P＜0.01）；可见黄芩提取物对小鼠体内的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌均具有明显的抑制作用。通过计算给药组对各组小鼠各段肠道中各致病菌的抑菌率，结果发现，黄芩提取物对金黄色葡萄球菌的抑制率最高，平均达到53%以上的抑菌率；对沙门氏菌的抑菌率次之，平均抑菌率达到36%以上；对大肠杆菌的抑菌率最低，平均为32%，且各个肠断抑菌效果差异性较大。

表3 各组小鼠各小肠段中细菌检测结果（logCFU·g-1）Table 3 Results of bacteria in small intestine of mice

3 讨论

黄芩为我国传统中药，文献资料显示，黄芩可用于治疗肠炎、痢疾等疾病。黄芩抗菌谱广，其煎剂对多种革兰阳性菌、革兰阴性菌及螺旋体等的生长均有抑制作用[5]。黄芩也具有抗真菌活性，对白色念珠菌、许兰毛癣菌等多种致病性真菌的生长有一定抑制作用[6-8]。研究证明，黄芩具有较强的抗菌作用，可能是抑制了ATP 合成酶[9]。这些也证明了，试验中黄芩提取物降低小鼠死亡率的原因。

目前中药体外抑菌方面的实验主要是采用试管二倍稀释法[1]，但在试验过程会受培养基、细菌接种量等方面的影响。但单纯的体外试验并不能真实地反映中药的抑菌效果，因为在兽医临床应用中，中药发挥作用是药物、细菌和机体三者间互相作用的结果。试验通过黄芩提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌体内外的抑菌效果，希望能对以后的研究提供一些参考。为畜禽疾病的防治提供理论依据。

4 结论

通过研究得出，黄芩提取物对常见的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌等致病菌具有较明显的体内外抑菌作用。

［1］辛文妤，宋俊科，何国荣，等.黄芩素和黄芩苷的药理作用及机制研究进展［J］.中国新药杂志，2013，22（6）：647-653.

［2］滕占才，王波，梁英.黄芩中黄芩苷常规回流浸提工艺优化研究［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2013，25（1）：70-73.

［3］栾耀芳，张凤花，吴国英，等.黄芩8 种中药对产β-内酰胺酶大肠埃希菌的敏感性研究［J］.山东中医杂志，2005，24（10）：629-631.

［4］杨景云.医用微生态学［M］.北京：中国医药科技出版社，1997.

［5］周立刚，张颖君，蔡艳，等.黄酮和甾体类化合物的抗真菌活性［J］.天然产物研究与开发，1997，9（3）：24 -29.

［6］张喜平，李宗芳，刘效恭.黄芩素的药理学研究概况［J］.中国药理学通报，2001，17（6）：711-713.

［7］Dai B，Cao Y，Huang S，et al.Baicalein induces programmed cell death in Candida albicans ［J］.J Microbiol Biotechnol，2009，19（8）：803-809.

［8］杨得坡，胡海燕.黄芩甙元和黄芩甙对皮肤真菌与细菌抑制作用的研究［J］.中药材，2000，23（5）：272 -274.

［9］Chinnam N，Dadi P，Sabri S，et al.Dietary bioflavonoids inhibit Escherichia coli ATP synthase in a differential manner［J］.Int J Biol Macromol，2010，46（5）：478-486.

［10］潘翠翠，郭永霞，王丽艳，等.甘草提取物对5 种植物病原菌的抑菌作用［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2014，26（3）：1-4.