SOE—PCR在稻瘟病菌基因敲除中的应用

摘要：稻瘟病是水稻重要病害之一，可引起大幅度减产。稻瘟病菌具有许多植物病原真菌侵染循环的重要特点，其侵染过程、致病机理和其中伴随的基因行为在致病真菌中具有典型性。本文综述了SOE-PCR技术的原理及其在稻瘟病菌基因敲除方面的应用情况，并指出此技术中要注意的问题，展望了其在稻瘟病研究中的应用前景。

关键词：重叠延伸PCR，稻瘟病菌，基因敲除技术

1.SOE-PCR技术的原理

重叠延伸PCR技术（gene splicing by overlap extension PCR，简称SOE PCR）[1，2]，是一种采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，在接下来的反应中通过重叠链的延伸，将来源不同的扩增片段重叠连接起来且不需要内切酶消化和连接酶处理的技术，该技术在敲除基因片段上具有很大的优势。

2.SOE-PCR技术在稻瘟病菌研究中的应用

从稻瘟病菌数据库中选取想要敲除掉的致病基因，并获得该基因的上、下游基因序列。以一段带有潮霉素标记的基因序列来代替欲敲除基因。SOE-PCR 是将不同来源的两个基因或DNA 片段拼接起来构成融合基因的方法。两段基因的引物其中有两条是常规的引物，两外两条引物是特殊设计的，其序列上一端与自身的目的片段互补，另外一端却是另外一段目的基因的序列。这样经过各自的PCR克隆后，在各自的产物其中的一端加上特别的接头。然后把PCR 产物处理后，利用接头的特异互补进行PCR 扩增，从而将两段PCR 产物连接到了一起，形成了不靠限制性内切酶连接的杂交基因片段。在重叠延伸PCR中，两个重叠的DNA片段是分别从两个独立的PCR扩增反应得到的，预设突变构建在重叠区域中。整个过程需要4对引物，用引物AF和AR，通过PCR的方法从稻瘟病菌基因组DNA扩增待敲除基因的上游A片段，接着用引物BF和BR再从稻瘟病菌基因组DNA中扩增待敲除基因的下游B片段，再用引物HYG/F和HY/R扩增出潮霉素磷酸转移酶序列内部的正向引物HPH1，用引物YG/F和HYG/R扩增出潮霉素磷酸转移酶序列内部的反向引物Hph2。再通过SOE-PCR的方法搭桥连接待敲除基因的上游A片段和Hph1、待敲除基因的下游B片段和Hph2，获得该基因的AH和HB片段。取上述PCR产物AH、HB片段各5μg，利用PEG介导的方法导入稻瘟菌的原生质体中。原生质体复苏后，在含有300 μgmL-1潮霉素的选择培养基上进行生长。5～7天后，在平板上挑取具有潮霉素抗性的转化子。将所挑取的转化子在固体酵母培养基中培养含3～5 天，收集菌丝，提取基因组DNA，进行PCR验证是否为敲除突变体。

3.SOE-PCR的优点及缺点

3.1优点：①操作步骤简洁，耗时短，可行性高；②不需要设计特定的酶切识别位点，将DNA片段拼接到一起；③可以进行高保真的定点、定位突变；④可以利用PCR将不同来源的DNA片段连接起来。一些基因来源的材料比较难得，很难将这些基因模板提取出来，并且提取出来的模板特异性不强。此时，利用重叠延伸PCR 技术，可以不需要从原始材料中获取目的基因，而是从其他含有目的片段模板中扩增，并实现突变、连接等。

3.2缺点：①容易产生随机突变，需要优化PCR过程；②对引物设计的要求很高。

4.展望

利用抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的方法之一，然而，水稻品种在生产上大面积推广3～5年后，抗性下降或丧失。研究者们利用对基因的加工和修饰来达到自己的研究目的，而前提是要获得目的基因。在实际操作中，某些目的基因的获得存在一定的困难，然而SOE-PCR技术不需要通过内切酶消化和连接酶处理即可获得，对于一些基因来源材料比较难得的基因，很难将这些基因模板提取出来，并且提取出来的模板特异性不强。可以不需要从原始材料中获取目的基因，而是从其他含有目的片段模板中扩增。使研究人员在基因操作上节省了大量时间。

参考文献：

[1]赵卫、胡志君、秦鄂德等。登革2型病毒全长cDNA 克隆定点诱变的OL-PCR 方法[J].中华微生物与免疫学杂志，2001，21（6）：662-665

[2]JonesML，BarnardRT.Chimerazation of multiple antibody classes using splice overlap extension PCR[J].Biotechniques，2005，38（2）：181-182.

[3] 钟志成，黎诚耀，朱利，张玲，万成松，马丹娟，杨瑜，熊建英，一种可用于多DNA 片段连接的新SOE-PCR方法[J].热带医学杂志，2010，10（3）：253-257

[4] 桑春果，张开春，张军科. 重叠区扩增法合成抗菌肽B 基因. 西北农林科技大学学报（自然科学版），2002，30（1）：66-67

作者简介：衣雨娇（1993～ ），女，汉，福建农林大学，植物保护学院大三学生。

（福建农林大学植物保护学院，福建福州 350000）