大孔树脂纯化毛脉酸模乙酸乙酯部位的研究
2015-08-05王宗伟王宗权贾力维王振月
王宗伟,郭 美,王宗权,贾力维,王振月
(1.黑龙江中医药大学药学院,哈尔滨150040;2.河北以岭医药集团医药研究院,石家庄050035)
毛脉酸模为蓼科酸模属植物.现已从毛脉酸模根中分离得到大黄素、大黄酚、大黄酚苷、芦荟大黄素、白藜芦醇、白藜芦醇苷等多种成分[1-2].白藜芦醇、白藜芦醇苷具有抗肿瘤[3]、保肝、抗炎抗氧化等多种药理作用;大黄素、大黄酚、大黄酚苷、芦荟大黄素等蒽醌类化合物具有抗菌消炎、保肝利胆[4]、泻下、抗癌[5]、抗病毒[6]等药理作用,课题组前期研究表明毛脉酸模50%乙醇提取物能明显抑制S180实体瘤和 H22实体瘤的生长[7],毛脉酸模乙酸乙酯部位具有抗肿瘤活性,毛脉酸模中二苯乙烯类成分对HepG2、Hela、MCF-7三种肿瘤细胞的体外生长具有抑制作用[8],通过二苯乙烯类成分诱导后HepG2细胞的2 474个肿瘤相关基因中,发现有GADD153,HPRG等5个基因表达明显上调,PRL-1,PAI-1等9个基因明显下调,说明二苯乙烯类成分能改变细胞周期进程、细胞增殖、细胞凋亡、血管生成等相关基因的表达来发挥抗肿瘤活性[9].药效组分学研究表明单一成分不能反映毛脉酸模功效的有效部位,对于开发新药乙酸乙酯部位成分十分复杂,制剂体积较大,为进一步减少服用剂量、便于携带,有必要对有效成分进行富集,制备其有效部位.本文以白藜芦醇、白藜芦醇苷、大黄素、大黄酚、大黄酚苷、芦荟大黄素6种成分作为考察指标,从3种树脂中筛选出富集纯化毛脉酸模乙酸乙酯部位的最佳树脂并优化大孔树脂纯化目标成分的最佳工艺条件.
1 仪器、材料和试剂
1.1 主要仪器
电热鼓风干燥箱(BGZ-246型,上海博讯),粉碎机(WND-200型,浙江省兰溪市伟能达电器有限公司),超声波清洗器(KQ-300E型,昆山市超声仪器有限公司),电子天平(LT501E型,常熟市天量仪器有限责任公司),分析天平(AL204,梅特勒-托利多仪器有限公司),恒温水浴锅(AHS6型,江苏省金坛市医疗仪器厂),高效液相色谱仪(waters600),waters2487检测器,Waters 717plus Autosampler,旋转蒸发仪(R -210型,BUCHI)等.
1.2 主要材料与试剂
毛脉酸模根2012年采自于黑龙江中医药大学药用植物园,经黑龙江中医药大学中药资源与开发教研室主任王振月教授鉴定为毛脉酸模的根,将该药材用粉碎机粉碎后备用.正丁醇(AR)沈阳市化学试剂厂,大孔树脂D101、AB-8、X-5(天津市汇达化工有限公司),石油醚(AR)天津市富宇精细化工有限公系,乙酸乙酯(AR)天津市富宇精细化工有限公系,无水乙醇(AR)天津永大化学试剂有限公司.白藜芦醇对照品、白藜芦醇苷对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄酚苷对照品、芦荟大黄素对照品(中国科学院成都生物研究所)等.
2 方法与结果
2.1 6种成分测定
2.1.1 色谱条件
色谱柱为 Gemini C185 μm 110A(250 ×4.6 mm);流动相为色谱甲醇-0.1%磷酸水50 min,流速1.0 mL/min;检侧波长为303 nm(用于测定白藜芦醇和白藜芦醇苷)和254 nm(用于测定大黄素、大黄酚、大黄酚苷、芦荟大黄素),进样量10 μL.
2.1.2 标准曲线的制备
分别精密吸取对照品溶液(白藜芦醇0.068 g/L、白藜芦醇苷0.090 g/L、大黄素 0.110 g/L、大黄酚 0.101 g/L、大黄酚苷 0.198 g/L、芦荟大黄素0.105 gL)2、5、10、15、20 μL 进样测定,分别以白藜芦醇、白藜芦醇苷、大黄素、大黄酚、大黄酚苷、芦荟大黄素的进样量(g)为横坐标,峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线.回归方程为白藜芦醇Y=2 126 872X -4 190,r=0.999 9(n=5);白藜芦醇苷 Y=1 837 899X -1 732 369,r=0.999 8(n=5);大黄素 Y=1 289 995X -137 050,r=0.999 8(n=5);大黄酚Y=1 678 624X -218 861,r=0.999 9(n=5);大黄酚苷Y=782 251X -200 028,r=0.999 9(n=5);芦荟大黄素 Y=1 629 439X-14 062,r=0.999 9(n=5)结果表明:白藜芦醇、白藜芦醇苷和大黄素、大黄酚、大黄酚苷、芦荟大黄素进样质量分别在0.136 ~1.360、0.180 ~1.800、0.220 ~2.200、0.202 ~2.020、0.396 ~3.960、0.210 ~2.100 μg 与峰面积积分值呈良好的线性关系.
2.2 样品溶液的制备
取毛脉酸模药材干燥根,粉碎后加入8倍量的50%乙醇,加热回流提取3次(时间为3、2、1 h),趁热滤过,合并滤液,蒸干并研成粉末,取50%乙醇提取物粉末,加入60倍量蒸馏水溶解,依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取,得毛脉酸模乙酸乙酯部位.取乙酸乙酯部位粉末适量加少量乙醇助溶并用水稀释到适宜浓度,备用.
2.3 树脂的筛选
分别取处理后的D101、AB-8、X-5树脂各10 g置250 mL量瓶中,加入取供试品溶液(测定白藜芦醇、白藜芦醇苷、大黄素、大黄酚、大黄酚苷、芦荟大黄素的质量浓度分别为 2.15、1.33、1.32、2.99、0.95、1.55 mg/mL)各 100 mL.振摇,放置 24 h,将吸附后树脂过滤,滤液定容,用HPLC法测定滤液中各成分的含量,计算树脂吸附溶液中各成分的吸附量;将吸附后的树脂装入树脂柱中,将吸附的成分用95%乙醇洗脱至洗脱液近无色,定容,测定各成分的解吸量,计算解吸率.
表1 3种树脂对6种成分的吸附性能
表2 3种树脂对6种成分的解析性能
由表1、2可以看出,综合考虑以上3中大孔树脂的吸附和解析性能,选择D101富集纯化毛脉酸模乙酸乙酯部位(白藜芦醇、白藜芦醇苷、大黄素、大黄酚、大黄酚苷、芦荟大黄素)的含量.
2.4 动态吸附-洗脱
2.4.1 最大上样量的考察
取经预处理的D101型湿树脂20 mL,湿法装柱,取上柱液(测得白藜芦醇、白藜芦醇苷、大黄素、大黄酚、大黄酚苷、芦荟大黄素的质量浓度分别为 2.12、1.31、1.28、2.89、0.91、1.52 mg/mL)以 2 BV·h-1的流速上样,按柱体积(每份20 mL)收集流出液,依次标号,测定其中流出液(白藜芦醇、白藜芦醇苷、大黄素、大黄酚、大黄酚苷、芦荟大黄素)的量,再绘制泄漏曲线.见图1.
图1 6种成分的泄漏曲线
由结果可知,在第2份时已有成分达到泄漏点,综合考虑(白藜芦醇、白藜芦醇苷、大黄素、大黄酚、大黄酚苷、芦荟大黄素)的泄露点,所以确定最大上样量为1 BV,即20 mL.
2.4.2 上样速率考察
取经预处理的D101型湿树脂20 mL,湿法装柱,选择流速分别为1、2、3 BV·h-1不同流速上样对树脂吸附量的影响.结果表明,在3 BV·h-1流速时,会使提早泄漏;流速1 BV·h-1时总上柱量并没有很明显的提高,考虑到工作效率,选择2 BV·h-1进行上样.
2.4.3 洗脱剂洗脱体积分数的考察
取经预处理的D101型湿树脂20 mL,湿法装柱,取上柱液20 mL以2 BV·h-1的流速上样,先用2BV的水、10% 乙醇、20%乙醇洗脱后,再分别用6 BV的10%、30%、50%、75%、95%乙醇以2 BV·h-1的速度洗脱,收集洗脱液,测定其中白藜芦醇、白藜芦醇苷、大黄素、大黄酚、大黄酚苷、芦荟大黄素的量,计算洗脱率.
表3 洗脱液体积分数对动态洗脱性能的影响
由表3可知,各有效成分主要集中在30%、50%、95%乙醇洗脱液中.将水、10%、20%、75%乙醇洗脱液回收溶剂后称重均有一定质量,说明有杂质被洗脱下来.因此选择水、20%、50%、75%、95%乙醇进行洗脱,合并50%、95%乙醇洗脱液为纯化部分.
2.4.4 洗脱溶剂体积的考察
取经预处理的AB-8型湿树脂20 mL,湿法装柱,取上柱液20 mL以2 BV·h-1的流速上样,先用3 BV的水洗脱后,用20%乙醇洗脱考察,至杂志质量无变化后,再用50%乙醇洗脱,分部收集洗脱液(每份20 mL),再用75%乙醇,至杂志质量无变化,再用95%乙醇洗脱,分部收集洗脱液(每份20 mL),分别以50%、95%乙醇洗脱液的各成分质量浓度为考察指标,绘制洗脱曲线.
结果表明20%、75%洗脱液体积为2.5 BV时杂志质量无变化,由图2、3表明:当洗脱剂用量为5 BV时50%、95%目标成分基本洗脱完成;洗脱液用量为 20%、50%、75%、95%乙醇各 2.5、5、2.5、5 BV进行梯度洗脱.
图2 50%洗脱液的洗脱曲线
图3 95%洗脱液的洗脱曲线
2.4.5 洗脱流速的考察
按上述吸附条件进行动态吸附后,先用3 BV水洗涤,再用 20%、50%、75%、95% 乙醇各 2.5、5、2.5、5 BV 进行梯度洗脱,分别以1、2、3 BV·h-1的流速进行洗脱,测定并计算50%和95%乙醇洗脱液中各成分的洗脱率.结合表4、5综合考虑,流速在2 BV·h-1,洗脱效率最佳.
表4 3种流速对50%乙醇中6种成分洗脱率的影响
表5 3种流速对95%乙醇中6种成分洗脱率的影响
2.5 大孔树脂纯化结果
取3份样品溶液,按选择的D101大孔树脂最佳纯化条件,上样,洗脱,洗脱液浓缩,结晶,过滤,真空干燥得到富集后产物,产物的得率为36.02%,产品中白藜芦醇、白藜芦醇苷、大黄素、大黄酚、大黄酚苷、芦荟大黄素的量从 25.24%提高到49.85%.
3 结语
本实验选择3种大孔吸附树脂,考察其对白藜芦醇、白藜芦醇苷、大黄素、大黄酚、大黄酚苷、芦荟大黄素的吸附率和解吸率,最终选择D101大孔吸附树脂纯化毛脉酸模乙酸乙酯部位的成分富集.提取工艺为:样品溶液最大上样量为1 BV,先用2 BV水洗涤,再用 20%,50%,75%,95%乙醇各 2.5、5、2.5、5 BV 进行梯度洗脱,流速 2 BV·h-1,合并50%和95%乙醇洗脱液,即为纯化的总有效部位,经D101树脂处理后,毛脉酸模乙酸乙酯部位的质量降低为处理前的36.02%,总有效成分(白藜芦醇、白藜芦醇苷、大黄素、大黄酚、大黄酚苷、芦荟大黄素)的量从25.24%提高到49.85%,纯度提高了1.98 倍.
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