超高效液相色谱－四极杆飞行时间质谱法快速筛查水产品中28种酸性合成色素

王萍亚， 周 勇， 戴意飞， 黄 鹂， 赵巧灵

（舟山市食品药品检验检测研究院，舟山市质量技术监督检测研究院，浙江舟山316021）

近年来，在食品中非法添加和滥用酸性合成色素的现象层出不穷。因此相关的检测方法［1-5］也随之受到关注和研究。合成色素与天然色素有着本质区别，合成色素由于色泽鲜艳、容易上色等特点主要应用于工业生产中。如对羊毛、皮革、蚕丝等进行染色处理，但均有一定程度的毒性。然而有些不法分子为节省成本，在食品中非法添加酸性合成色素，如酸性黄［6］、酸性红［7］等，对人体健康和社会稳定产生了极大的危害。但考虑到酸性合成色素种类繁多，无法一一列明，因此有必要针对目前市场上常见的28种酸性合成色素建立筛查方法，从而为有效遏制非法添加行为和食品安全风险预警提供技术手段。

目前色素的检测方法很多，如毛细管电泳法［8］、高 效 液 相 色 谱 法［9-11］、液 相 色 谱-质 谱法［12-15］等。液相色谱与质谱联用技术能够在一定程度上排除基质干扰，对于基质复杂、需要高灵敏度、宽适用范围的检测工作而言，它已成为最佳的手段之一。四极杆飞行时间质谱（Q-TOF MS）作为高分辨质谱，能测定得到精确质量数，并且通过数据库进行一级、二级质量数匹配和同位素匹配等进行化合物鉴定，特别是对非特定的目标化合物进行鉴定，同时可以对检测到的阳性目标物进行定量。但目前对未知添加色素的筛查技术研究较少，且未见水产品中未知添加色素检测的相关报道。

因此，本文以水产品为研究对象，对其中28种禁用的酸性合成色素进行分析，建立了UPLC-QTOF MS筛查方法。对样品前处理方法、液相色谱条件、质谱条件进行了系统优化，为水产品中酸性合成色素高通量的筛查和确证提供了可行的方法。

1 实验部分

1.1

仪器与试剂

Agilent UHPLC和Agilent 6540-Q-TOF MS（Agilent，美国）；Avanti®J-E 高速冷冻离心机、Talboys涡旋混合器、N-EVAPTM-112氮吹仪、样品萃取管；甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯，均购自上海安谱实验科技股份有限公司；无水硫酸镁、乙酸铵、丙酮、正己烷、乙醇和氨水（质量分数25%～28%）为分析纯；C18填料（40 ～63 μm）、聚酰胺粉（100 ～200目）均购自上海安谱实验科技股份有限公司；实验用水为Milli-Q超纯水。

标准物质：苋菜红（Amaranth，纯度89%）、日落黄（Sunset Yellow FCF，纯度 90%）、靛蓝（Indigo carmine 91%）、亮黑 BN（Brilliant Black BN，纯度91%）、萘酚黄（Naphthol Yellow，纯度 89%）、酸性红（New Coccine，纯度 91%）、酸性黄（Acid Yellow，纯度89%）、喹林黄（Quinoline Yellow，纯度 91%）、酸性红 2G（Acid Red 1，纯度 89%）、亮绿 SF（Light Green SF Yellowish，纯度 91%）、偶氮玉红（Carmoisine，纯度91%）、酸性红26（Ponceau Xylidine，纯度91%）、羊毛绿（Wood Green S，纯度 91%）、橙色 I（Orange I，纯度 91% ）、橙色 II（Orange II，纯度91%）、监牢绿 FCF（Fast Green FCF，纯度 91%）、萘酚蓝黑（Naphthol Blue Black，纯度91%）、酸性蓝（Brilliant Blue FCF，纯度91%）、酸性红 52（Sulforhodamine B，纯度 91%）、赤藓红（Erythrosine，纯度91%）、荧光桃红（Phloxine B，纯度 91%）、酸性黄 36（Metanil Yellow，纯度 91%）、酸性绿 3（Guinea Green B，纯度91%）、荧光素钠（Uranine，纯度 91%）、孟加拉玫瑰红（Rose Bengal，纯度91%）、酸性红87（Eosin Y，纯度91%）、丽春红 SX（Ponceau SX）均购于上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取28种酸性合成色素标准品各10 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，配制成1 g／L的单标准储备液（-20℃保存），再分别吸取1 g／L的28种单标准储备液各1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容得10 mg／L的混合标准溶液。用初始流动相将其稀释成相应的标准工作溶液，于4℃保存。

1.3 样品前处理

称取2.0 g样品于50 mL带盖聚四氟乙烯离心管中，加入10 mL 氨水和乙醇水溶液（2∶7∶1，v／v／v），涡旋混匀后于80℃水浴中浓缩至4 mL，用200 g／L柠檬酸调节提取液 pH值至 4.0，以 10 000 r／min冷冻离心10 min，将上清液转移至基质分散管中，管内装有氨基化吸附剂（1 000 mg无水硫酸镁、50 mg C18粉末、200 mg聚酰胺粉末），振荡基质分散管5 min，以10 000 r／min冷冻离心10 min，去除上清液，然后向沉淀中加入5 mL氨水-甲醇（30∶70，v／v）洗脱，重复洗脱一次后合并两次洗脱液，用氨化甲醇定容10 mL，取1 mL用氮气吹干，再用 0.2 mL 甲醇-水（50∶50，v／v）溶解，过 0.22 μm有机滤膜后供UPLC-Q-TOF MS分析测定。

1.4 色谱－质谱条件

1.4.1 色谱条件

Agilent Eclipse Plus-C （100 mm ×3.0 mm，1.8 μm）作为分析柱，柱温为30℃；流动相A相为5 mmol／L 乙酸铵-0.1% （v／v）甲酸水溶液，B 相为乙腈。梯度洗脱程序：0～1 min，5%B～20%B；1～10 min，20%B ～100%B；10 min～15 min，100%B。进样体积为3 μL；流速为0.2 mL／min。

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子（ESI）源；扫描方式：负离子全扫描；全扫描范围：m／z 50～1 100；毛细管电压：3 500 V；离子源喷雾电压：1 500 V；离子化电压：130 V；鞘气温度：350℃；干燥气温度：325℃；鞘气流速：11 L／min；干燥气流速：8 L／min；数据采集模式：全息离子扫描（Allions MS／MS）。参比溶液中含三氯乙酸（C2HF3O2，精确相对离子质量为112.985 5）和六（1H，1H，3H-全氟丙氧基）磷氮的三氟乙酸加合离子（C20H19F27N3O8P+3，精确相对离子质量为1 033.9 881）。

数据采集与处理通过Agilent Mass Hunter Workstation Software （Version B.05.00）软件完成，碎片离子数据库建立通过Agilent Mass Hunter PCDL Manager（B.04.00）软件完成。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

选取负离子模式，在全扫描方式下优化离子化电压、毛细管电压、碰撞电压等参数。离子化电压和毛细管电压是质谱离子源的一项关键参数，该参数直接影响目标化合物的检测灵敏度。随着离子化电压和毛细管电压的逐渐增大，离子的响应强度会逐渐增强，响应达到一定值后，离子的响应又逐渐减弱。本实验考察了离子化电压为100～150 V以及毛细管电压为3 000～5 500 V的影响，结果表明在130 V的离子化电压和3500 V的毛细管电压下，所有的目标化合物均能够得到比较满意的准分子离子峰，因此本文以130 V作为最佳采样离子化电压，根据优化结果采集数据。其次优化了碰撞电压，通过设定5～80 V的碰撞电压，根据二级离子灵敏度的总体情况进行调节，最终选择了两个碰撞能量，低能量值为10 V，高能量为40 V，由于高分辨质谱的筛查需要准确质量的二级图谱碎片进行匹配，所以通过不同的碰撞电压进行碎裂，并用全息二级图谱建立数据库，最终确定了用于酸性合成色素分析的质谱条件，同时用一级质量数、同位素丰度和二级碎片信息等建成一个完整的数据库，用于质谱筛选。

2.2 流动相的选择

本实验选择甲醇-0.1%（v／v）甲酸水溶液、乙腈-0.1% （v／v）甲酸水溶液、甲醇-含 0.1% （v／v）甲酸的5 mmol／L 乙酸铵溶液、乙腈-含0.1% （v／v）甲酸的5 mmol／L乙酸铵溶液作为流动相，分析比较了多种酸性合成色素的分离效果。结果表明，乙腈的分离效果明显优于甲醇，同时乙腈的洗脱能力更好，提高了分析效率；而乙酸铵能够得到较好的酸性合成色素峰形，相比之下纯水的效果较差；且在乙酸铵溶液中加入0.1%（v／v）甲酸，虽然在负离子条件下灵敏度有一定程度的损失，但实验发现其影响在可接受的范围内，同时峰形和分离度有明显改善。因此比较了在乙酸铵溶液中添加不同体积分数（0%、0.1%、0.2%、0.5%）的甲酸对色谱峰的影响，结果表明含0.1% （v／v）甲酸的5 mmol／L乙酸铵溶液和乙腈为最佳的流动相。由此，通过优化质谱条件和流动相确定最终的采集方法，然后通过标准物质采集获得28种酸性合成色素的分子特征提取色谱图（见图1）。

图1 28种酸性合成色素的UPLC－Q－TOF MS分子特征提取离子色谱图Fig.1 Molecular feature of extracted chromatograms of the 28 acidic artificial dyes by UPLC－Q－TOF MS

图1 （续）Fig.1 （Continued）

通过Allions MS／MS模式一次进样同时检测28种酸性合成色素的质谱全扫描信息，在化学工作站设置28种酸性合成色素质谱检测的母离子及保留时间等信息，检测得到的质谱特征离子如表1所示。

表1 水产品中28种酸性合成色素的保留时间和质谱信息Table 1 Retention times and MS information of the 28 acidic artificial dyes in fishery products

2.3 方法学验证

2.3.1 标准曲线、检出限与精密度

配制20～10 000 μg／L的系列标准溶液，以峰面积（Y）对相应的质量浓度（X，μg／L）分别绘制28种酸性合成色素的标准曲线。将200 μg／L混合标准溶液连续检测6次，计算峰面积的相对标准偏差（RSD）。各酸性合成色素的线性范围、相关系数（r）和峰面积的RSD见表2。结果表明，28种酸性合成色素在各自的线性范围内线性关系良好（r≥0.991）。

表2 28种酸性合成色素的线性范围、相关系数（r）和200 μg／L时峰面积的RSDTable 2 Linear ranges，correlation coefficients （r）and RSDs of the peak areas of the 28 acidic artificial dyes at 200 μg／L

2.3.2 回收率、检出限与定量限

根据3倍、10倍信噪比（S／N）分别确定检出限（LOD）、定量限（LOQ）。在阴性的鲳鱼样品基质中添加100、200和500 μg／kg 3个水平的混合标准溶液，按1.3节方法进行预处理，每个水平重复测定6次，得到28种酸性合成色素的回收率、LOD与LOQ（见表 3）。28 种目标物的 LOD 为 5 ～50 μg／kg，LOQ 为20 ～100 μg／kg；且在 3 个不同加标水平下28种酸性合成色素的回收率分别为70.24%～106.47%，可以满足国内外水产品中酸性色素检测的要求。

表3 鲳鱼中28种酸性合成色素的加标回收率、RSD、检出限和定量限Table 3 Recoveries，RSDs，LODs and LOQs of the 28 acidic artificial dyes spiked in Pampus argenteus

表3 （续）Table 3 （Continued）

2.4 方法的应用

选取市售22份水产品（白蟹、富贵虾、小黄鱼、大黄鱼、龙头鱼、黄姑鱼、梅童鱼、鮸鱼、玉秃、鲳鱼、带鱼、青占鱼、马鲛鱼、鳓鱼、鲭鱼、鱿鱼、乌贼、海带、海蜇、海地瓜、蛏子和文蛤）进行检测，结果未发现阳性样品，下一步将以水产品加工品作为采集对象，扩大筛查范围。按照本方法筛选，以酸性红为例，图2是酸性红的二级碎片质谱图，可获得相应的母离子和碎片离子信息。经过精确分子质量及标准物质谱图数据库的检索，28种目标物的匹配度均大于85%，说明建立UPLC-Q-TOF MS技术可快速有效地筛查水产品中28种酸性合成色素。

图2 酸性红的二级碎片图谱Fig.2 Fragment spectrum of New Coccine

3 结论

本文建立了UPLC-Q-TOF MS快速筛查水产品中28种酸性合成色素的方法，该方法简便快速，灵敏度高，其回收率及重复性能满足日常检测的要求。采用氨基化吸附剂基质分散法对样品净化处理，可有效地减少样本中杂质的干扰。且该方法具有高通量、高灵敏度、高分辨率、高质量精确度及可行的线性范围，可利用四极杆串联飞行时间质谱定性的功能，对28种酸性合成色素进行检测筛查，适用于水产品中违禁添加色素化合物的快速确证。

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