高效液相色谱法同时测定防晒类化妆品中15种紫外线吸收剂

孟宪双， 马 强， 白 桦， 张 庆， 吕 庆

（中国检验检疫科学研究院，北京100176）

自20世纪50年代国际上开始广泛使用防晒化妆品以来，防晒已成为当今化妆品领域的热门话题之一。防晒剂按其防晒机理的不同，大体分为紫外线吸收剂和紫外线散射剂（物理阻挡剂）［1］，前者如水杨酸类、对氨基苯甲酸类、香豆素类等物质，这些物质的分子能够吸收紫外线的能量，然后再以热能或无害的可见光效应释放出来，从而保证皮肤免受紫外线的伤害；后者主要包括氧化锌、二氧化钛、氧化亚铁等物质，主要通过散射作用以减少紫外线与皮肤的接触来防止紫外线对皮肤的侵害，其防晒效果不如前者明显，价格较高；加之前者更易用于配方，所以市售防晒剂80%为紫外线吸收剂［2-4］。近年来，防晒化妆品的需求逐年增加，与之相对应的安全性问题也越来越受广大消费者的关注。紫外线吸收剂为化学合成物质，在紫外线作用下会分解和裂变［5，6］，降解后的小分子容易被皮肤吸收［4］，存在诱发丘疹和脓疱，甚至光毒性和皮肤过敏等风险［7］。目前欧盟及各国对紫外线吸收剂的使用分别作了限量要求［2］，我国《化妆品卫生规范》（2007 年版）（以下简称《规范》）［8］对 28种防晒剂（26种紫外线吸收剂和2种紫外线散射剂）的限量做了明确规定。因此，建立防晒化妆品中紫外线吸收剂的高效、准确、灵敏的检测方法，对加强产品的质量安全监管具有重要意义。

据国内外文献报道，国外研究者近年来的研究对象主要集中在植物［9］、鱼类组织［10］、水样［11，12］等中的紫外线吸收剂，采用的检测手段为液相色谱-质谱（LC-MS）联用技术；近几年国内学者对化妆品中紫外线吸收剂的检测方法开展了相关研究，检测方法绝大多数为 HPLC 法［1，2，13-18］。本研究在系统总结同行学者的相关工作后，注意到在紫外线吸收剂的选择方面，《规范》及国内报道［1，2，13-16］中的研究对象主要集中在甲氧基肉桂酸异戊酯、胡莫柳酯、水杨酸乙基己酯、丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷、苯基苯并咪唑磺酸、4-甲基苄亚基樟脑及二苯酮-3，其使用频度也较高［19］，且《规范》也对其在化妆品中使用的限量值做了规定（见表1），少数文献也研究了二乙氨基羟苯甲酰基苯甲酸己酯及二苯甲酮［1，13，15，20］。二苯酮类化合物属于市售化妆品中易添加的紫外线吸收剂品种［16］，虽然《规范》只针对其中的二苯酮-3、二苯酮-4和二苯酮-5的限量值进行了规定，但鉴于二苯酮属于一大类化合物，其化学性质相近，且均可作为紫外线吸收剂或者紫外线吸收剂辅助制剂，因此，本文在选取上述9种常见紫外线吸收剂外，同时将二苯酮-1、二苯酮-2、二苯酮-6、二苯酮-8、二苯酮-10及二苯酮-12作为研究对象，总共囊括了对氨基苯甲酸（p-aminobenzoic acid，PABA）及其衍生物、水杨酸酯（salicylates）及其衍生物、肉桂酸酯类（cinnamates）、二苯甲酮类化合物 （benzophenones）、邻氨基苯甲酸酯（anthranilate）及其衍生物、樟脑类衍生物（camphor derivatives）及二苯甲酰甲烷类（dibenzoyl methanes）在内的15种紫外线吸收剂。针对《规范》及文献中采用的样品处理及检测方法，归纳起来主要存在以下几个问题：a.在前处理过程中使用的四氢呋喃和高氯酸，在上机测定前并未除去，容易对仪器管路聚醚醚酮（PEEK）材料和色谱柱造成腐蚀；b.单以甲醇作为提取溶剂不适合所有基质类型，尤其对某些唇膏等蜡质样品并不能使其完全分散，从而造成回收率偏低，因此方法的普适性不高；c.流动相采用高浓度的异丙醇极易造成柱压上升，使系统难以平衡，造成基线漂移；d.采用高氯酸作为酸性改性剂，引起强氧化性，会缩短色谱柱的使用寿命，腐蚀仪器的管路等部件。因此，本文选取最大范围的基质类型（包括化妆水、乳液、膏霜及唇膏等）进行研究，对上述文献中普适性较窄的提取溶剂进行改进；对前处理过程中采用的合适的提取溶剂进行浓度及用量上的优化；对分析前不适宜的样品溶剂进行有效处理，选择合适的上机溶剂且不降低物质的响应强度；对分析过程中采用的流动相种类及改性剂进行优化，尽量使色谱仪在采样过程中的基线保持平稳，把仪器对定量结果准确性的影响降至最低程度。本文在系统优化的基础上，采用常规的C18色谱柱，实现了15种紫外线吸收剂的全部基线分离，方法定量准确，便于推广普及，为防晒类化妆品的质量安全监管提供了实用有效的检测方法。

表1 15种紫外线吸收剂的相关信息及在化妆品中的最大允许使用量［8］Table 1 Information and the maximum permissible contents of the 15 UV filters in cosmetics［8］

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 1200高效液相色谱仪，配在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器（美国Agilent公司）；甲醇和四氢呋喃（色谱纯，美国Fisher公司）；饱和氢氧化铵溶液（分析纯，北京化工厂）。

p-甲氧基肉桂酸异戊酯、4-甲基苄亚基樟脑、二苯酮-2、二苯酮-3、二苯酮-10、二苯酮-8、二苯酮-6、二苯酮-12及二苯酮-1均购自百灵威科技有限公司；胡莫柳酯、水杨酸乙基己酯、丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷、二乙氨基羟苯甲酰基苯甲酸己酯、苯基苯并咪唑磺酸及二苯甲酮购自Sigma-Aldrich公司；标准品的纯度均大于92%。

样品：市售的33份化妆品，其中包括化妆水9份、乳液7份、膏霜12份和唇膏5份。

1.2 标准溶液的配制

准确称取各紫外线吸收剂标准品50 mg（精确至0.1 mg）于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，即得1 g／L的标准储备液，保存于4℃条件下；分别准确量取1 mL各标准储备液至20 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成50 mg／L的混合标准储备液，再用甲醇逐级稀释成20、10、5、2、1、0.5、0.2 mg／L 的混合标准工作溶液。

1.3 样品前处理

对于除唇膏外易于分散的试样：称取0.5 g（精确至0.001 g）试样于25 mL具塞比色管中，向比色管中加入4 mL四氢呋喃（含2 g／L氢氧化铵），涡旋振荡混匀，再加入80%（v／v）甲醇水溶液定容至10 mL，涡旋混匀，然后超声提取10 min。取部分提取溶液转移至10 mL具塞塑料离心管中，以10 000 r／min离心10 min，取2 mL上清液经氮吹仪吹扫近干后，用2 mL甲醇重新溶解，经0.45 μm微孔滤膜过滤后进行测定。

对于唇膏等不易分散的蜡质试样：加入4 mL四氢呋喃（含2 g／L氢氧化铵），涡旋振荡，如仍不能使试样完全分散，可采用超声振荡加热（50℃）的方式使试样分散完全，然后向比色管中加入80%（v／v）甲醇水溶液，定容至10 mL，后续步骤与其他样品相同。

1.4 液相色谱条件

色谱柱：Waters XTerra MS C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：A 相为水（含 0.1% （v／v）甲酸），B 相为甲醇（含 0.1% （v／v）甲酸）；流速：1 mL／min；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；梯度洗脱程序：0～5 min，55%A ～25%A；5 ～8 min，25%A ～22%A；8 ～10 min，22%A；10 ～20 min，22%A ～10%A；20 ～21 min，10%A ～5%A；21 ～23 min，5%A；23 ～24 min，5%A ～55%A；24 ～28 min，55%A。检测波长：280 nm和311 nm。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的优化

化妆水、乳液、膏霜及唇膏类化妆品的组成成分千差万别。鉴于化妆品不同类型样品在前处理过程中的分散难易程度不同，并参考相关文献［1，2］，本实验采用不同体积分数（50%、60%、70%、80%、90%）的甲醇水溶液对空白加标试样中的目标物质进行提取。结果表明，除唇膏等蜡质试样外，其他基质类型样品在高甲醇含量的水溶液提取条件下，仍有部分目标物质的提取效率不高，而且唇膏等蜡基质试样用甲醇也无法分散完全，从而导致目标物质回收率较低。针对该问题，本实验在试样中首先加入四氢呋喃分散样品，然后加入80%（v／v）甲醇水溶液进行提取的方法进行样品中目标物质的提取。实验结果显示，除唇膏类样品外，其他基质类型化妆品试样在4 mL四氢呋喃及6 mL 80%（v／v）甲醇水溶液提取条件下所有目标物质均有较高的回收率。而对于某些唇膏等蜡基质类型样品，加入四氢呋喃后仍不能使其分散完全，因此本实验采用振荡加热至50℃的方式使唇膏等基质分散完全，结果显示，此条件下试样分散效果较好，目标物质的回收率达到满意的效果。

当降低空白加标水平至0.1%（质量分数）以下时，除2-苯基苯并咪唑-5-磺酸回收率较低外，其他目标物质的回收率均达到80%以上。根据2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的化学结构式，其带有磺酸基，在中性条件下为解离状态，离子状态使得其增加了在水相中的溶解度，从而导致其回收率偏低。因此，在提取溶剂中加入流动相中常添加的酸性改性剂甲酸来抑制2-苯基苯并咪唑-5-磺酸中磺酸基团的解离。实验结果显示，在该物质含量较低时，可以显著提高目标物质回收率；但在高浓度时，回收率仍偏低。考虑到该物质在氨化甲醇中有良好的溶解度，因此本实验又考察了在四氢呋喃中添加不同浓度的氢氧化铵条件下各物质的回收率效果。实验结果表明，添加2 g／L氢氧化铵可使得2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的回收率明显提高，而且其他物质的回收率均不受影响。因此，最终确定采用4 mL含2 g／L氢氧化铵的四氢呋喃溶液预处理试样，然后加入6 mL 80%甲醇水溶液进行提取的前处理条件。

2.2 液相色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的选择

色谱柱的种类对分析结果有至关重要的影响，C18柱和苯基柱是实验室常用的反相色谱柱。因采用不同的键合技术和硅羟基封端基团的不同，虽同为C18填料，但其选择性存在区别。本实验中选择了 Waters XTerra C18、Agilent Zorbax SB-Phenyl、大连依利特公司的 Kromasil C18、Agilent Zorbax SB C184种不同品牌、选择分离性存在差异的色谱柱（规格均为250 mm×4.6 mm，5 μm）分别进行梯度洗脱条件优化。结果表明，二苯酮-1、二苯酮-8和二苯甲酮在Agilent Zorbax SB-Phenyl和 Kromasil C18色谱柱上难以分离；而Agilent Zorbax SB C18对水杨酸乙基己酯和胡莫柳酯的色谱分离存在难度；在Waters XTerra C18柱上经梯度洗脱条件的优化，实现了15种紫外线吸收剂的全部基线分离。

2.2.2 流动相的选择

文献［13，15］分别选择了高浓度的异丙醇和四氢呋喃作为流动相，实验发现，异丙醇由于黏度较高，容易引起色谱系统的压力上升，造成基线不稳；而四氢呋喃作为一种常见的环醚，易被氧化，对PEEK管路造成损坏，且毒性较强。因此，本研究考虑采用常规的甲醇或乙腈和水添加一定浓度的酸性改性剂作为流动相，以期实现15种目标物质的分离。采用乙腈和水为流动相进行洗脱时，由于乙腈的洗脱能力较强，实现基线分离较为困难；以甲醇和水为流动相进行洗脱时，洗脱效果明显好转，通过梯度条件的优化，基本实现全部目标物的分离，但2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的色谱峰拖尾严重。

为了改善目标物的色谱峰形，在流动相中分别添加0.1%甲酸，结果发现，2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的色谱峰形明显较未添加酸性改性剂时对称，且明显改善了各物质间的分离度。15种紫外线吸收剂的色谱分离谱图见图1。

图1 280 nm和311 nm检测波长下15种紫外线吸收剂的液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of the 15 UV filters at two detection wavelengths of 280 nm and 311 nm

2.2.3 检测波长的选择

通过二极管阵列检测器对15种目标化合物在200～400 nm范围扫描，发现除二苯甲酮在280 nm波长附近存在最大紫外吸收外，其他所有化合物均在311 nm波长附近有最大紫外吸收，因此，确定同时采集280 nm和311 nm波长下的色谱分离图谱，除二苯甲酮采用280 nm波长下的紫外吸收值定量外，其他化合物均采用311 nm波长下各自的紫外吸收值进行定量计算。

2.3 方法的线性关系及定量限

在1.4节的最佳分析条件下，分别对系列质量浓度的混合标准工作溶液进行测定，以各化合物的质量浓度X（mg／L）为横坐标、色谱峰面积Y为纵坐标进行线性回归，建立标准工作曲线。结果表明，15种紫外线吸收剂在0.5～50 mg／L范围内呈良好的线性关系（r2≥0.999 1）（见表2）。

在不含目标物质的空白化妆品基质中添加不同浓度的目标化合物标准溶液，按照建立的实验方法进行预处理和分析测定，以10倍信噪比（S／N=10）对应的化合物浓度作为目标物质的方法定量限，结果见表2。

2.4 回收率及精密度

在经测定不含15种紫外线吸收剂的空白样品中添加低、中、高3个水平的目标物标准溶液，按照1.3节和1.4节下的条件进行样品处理和分析测定，用标准工作曲线定量，计算方法的回收率。15种紫外线吸收剂在低、中、高3个添加水平下的平均回收率为84.2%～100.7%，相对标准偏差（RSD）为0.9%～9.5%（见表3）。由此可见，该方法具有良好的准确性和精密度。

表2 15种紫外线吸收剂的保留时间、线性方程、相关系数及定量限Table 2 Retention times （tR），linear equations，correlation coefficients （r2）and LOQs of the 15 UV filters

表3 不同类型化妆品中15种紫外线吸收剂的加标回收率和精密度（n＝6）Table 3 Recoveries and precisions（RSDs）of the 15 UV filters spiked in blank cosmetics（n ＝6）

表3 （续）Table 3 （Continued）

2.5 实际样品的检测

按照本实验建立的方法对市售的33份化妆品进行紫外线吸收剂的测定，从1份化妆水和1份乳液样品中检出p-甲氧基肉桂酸异戊酯（含量分别为6.7%和8.1%），1份唇膏样品中检出4-甲基苄亚基樟脑（含量3.7%），其含量值均在我国规定［8］的限量范围内，其他样品均未检出。检出的阳性样品同时采用液相色谱-串联质谱法进行了确证，结果显示被检出样品无假阳性；对阴性样品进行LC-MS／MS分析，无目标成分被检出。

3 结论

本研究系统总结了近几年学者关于紫外线吸收剂检测方法的研究工作，主要针对其方法对样品的普适性、样品前处理技术中的样品分散溶剂、萃取溶剂和萃取时间、LC分析中流动相种类等主要参数进行了改进和优化，并选取包括对氨基苯甲酸类、水杨酸酯类、肉桂酸酯类、二苯甲酮类、邻氨基苯甲酸酯、樟脑类衍生物和二苯甲酰甲烷类等在内的15种代表性紫外线吸收剂为研究对象，开发了化妆水、乳液、膏霜及唇膏等防晒类化妆品中的相关检测方法。实验结果表明，所建立的方法回收率高，精密度良好；用于实际样品的检测，成功检出多例阳性样品，通过液相色谱-串联质谱法确证，无假阳性和假阴性结果出现，说明本研究改进的方法准确、可靠、普适性高，可用于防晒类化妆品中15种紫外线吸收剂的实际检测工作。

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