气相色谱－三重四极杆串联质谱法测定白芍中99种农药残留

刘小勤， 佟 玲， 孟文婷， 孙国祥*

（1.沈阳药科大学药学院，辽宁沈阳110016；2.天士力控股集团研究院药物分析所，天津300402）

我国是中药材种植大国，然而我国在世界中药资源市场上的占有额不高，由环境污染（如农药残留）引起的药材质量问题是主要原因之一。随着国际农药残留限量标准日趋严格，如欧盟针对植物药中70类农药（包括异构体及毒性代谢产物）进行了严格的限量规定［1］，对于没有登记使用的农药按照一律限量标准（0.01 mg／kg）执行，而多数发展中国家的检测技术难以达到这一水平，这无疑为中药材出口增加了难度。因此，建立快速、简便、灵敏度高的分析方法对中药材中多种农药残留量进行监测具有十分重要的现实意义。

白芍是我国常用的传统中药，为毛茛科植物，以根入药。白芍在种植过程中易感染多种病虫害且发病率高，滥用农药造成了白芍的直接污染，此外，白芍生长周期长（一般3～4年［2］），土壤和空气中残留的农药容易在植物组织中富集，又会对白芍产生间接污染［3］。然而，目前针对白芍中农药多残留缺乏系统性的研究，2010年Gao等［4］采用气相色谱法测定了白芍中检出率较高的20种农药残留，虽然方法灵敏度高，但电子捕获检测器缺乏选择性，在实际样品测定过程中容易产生假阳性；同年，林建［5］研究了多菌灵和三唑酮在杭白芍中的消解动态和残留行为，但该研究仅涉及上述两种农药，应用性不强；2013年汪佳凤等［6］采用气相色谱-串联质谱法测定了白芍中10种有机磷农药残留量，但检测指标覆盖不全，难以对白芍中多种农药残留进行全方位监控。其他的文献报道［7-9］也普遍存在以上问题。综上，目前对白芍中多种农药残留量的监控缺乏切实有效的分析方法，难以为白芍的临床应用提供安全性保障。

本文根据欧盟对植物药制定的农药残留检测项目，针对白芍受农药污染情况和其基质复杂的特点，利用NH2固相萃取净化技术，同时结合三重四极杆质谱仪选择性高、抗干扰能力强的特点，建立了99种农药同时测定的分析方法。用基质匹配标准曲线内标法进行定量，对基质效应进行了补偿。该方法灵敏度高、准确性好，满足白芍中农药残留检测的要求，同时也为其他根类药材的多农药残留检测提供借鉴。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

GCMS-TQ8030型气相色谱-质谱联用仪（日本SHIMADZU公司），配AOC-20i+s型自动进样器；CF16RN型高速微量离心机（日本HITACHI公司）；R-215型旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）；HZS-H型水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；Milli-Q超纯水系统（美国 Millipore公司）；XS105型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

丙酮、二氯甲烷、甲醇、乙腈、乙酸乙酯均为色谱纯（德国Merck公司）；实验用水为Milli-Q超纯水系统所制超纯水；NH2固相萃取柱（500 mg／6 mL）、CARB／PSA 固相萃取柱（500 mg／500 mg／6 mL）和C18固相萃取柱（500 mg／6 mL）均为 DIKMA科技公司生产；无水硫酸钠为优级纯（天津市光复精细化工研究所）；醋酸钠为分析纯（天津市化学试剂一厂）；99种农药标准品购自农业部环境质量监督检验测试中心和德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度大于95%；以丙酮配制成质量浓度为100～1 000 mg／L的各农药标准储备液，再准确量取一定体积的各农药标准储备液，用丙酮定容，得到质量浓度为2 mg／L的99种农药混合标准溶液，于-18℃下避光保存。

白芍药材购于亳州中药材市场，产地：安徽。

1.2 样品前处理

取白芍药材，粉碎。取粉末4.0 g，精密称定，置于50 mL聚丙烯塑料离心管中，加入10 mL水浸润30 min。用移液管准确加入20 mL乙酸乙酯，超声处理30 min，向离心管中加入4 g无水硫酸钠和1 g醋酸钠，涡旋振摇2 min，以10 000 r／min的速度离心3 min，取上清液10 mL于150 mL圆底烧瓶中，于40℃水浴旋转蒸发至近干，用2 mL二氯甲烷-甲醇（100∶1，v／v）溶解，待净化。

用3 mL 二氯甲烷-甲醇（100∶1，v／v）预淋洗固相萃取小柱，将待净化液转移至柱中，用15 mL二氯甲烷-甲醇（100∶1，v／v）分 3次淋洗小柱。流出液全部收集于100 mL鸡心瓶中，于40℃水浴中旋转浓缩至近干，用2 mL丙酮复溶，待 GC-MS／MS测定。

1.3 混合标准工作溶液的配制

向5 mL量瓶中加入适量氘代毒死蜱-D10（内标）溶液及混合标准溶液，用1.2节所述提取净化后的空白样品液定容至刻度。得到质量浓度分别为1、5、10、20、50、100、200、250 μg／L 基质匹配标准工作溶液，其中内标溶液的质量浓度均为50 μg／L。

1.4 GC－MS／MS 条件

GC条件 InertCap 5MS／HP气相色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm；日本 SHIMADZU 公司）；载气：氦气（纯度≥99.999%），流速为 1.69 mL／min；进样口温度为 250 ℃；进样量 1.0 μL，不分流进样；升温程序：50℃保持1 min，以25℃／min的速度升温至125℃，再以10℃／min升温至300℃，保持1.5 min，总运行时间为25 min。

MS条件 电子轰击电离源（EI源）电压为70 eV；离子源温度200℃；接口温度250℃；溶剂延迟时间2.8 min；碰撞气：氩气（纯度≥99.999%）；岛津GC Solution工作站。

1.5 基质效应的评价

按照美国临床实验室标准化委员会的定义，基质效应指样品中除目标分析物以外的其他成分对待测物测定值的影响，即基质对分析方法准确测定分析物能力的干扰［10］。基质效应的存在能增强或抑制组分的信号响应值［11］。为了准确评价白芍基质对测定结果准确度的影响，本文同时选取两组分别由溶剂和空白基质溶液配制的混合标准工作溶液，GC-MS／MS测定后，绘制标准工作曲线，按下式［12］计算基质效应（MF）：

其中，S溶剂指溶剂混合标准工作溶液的线性方程斜率；S基质指基质匹配标准工作溶液的线性方程斜率。

2 结果与讨论

2.1 GC－MS／MS 分析参数的优化

2.1.1 产物离子的选择

在多农药残留分析中，一般判别样品是否有农药检出需满足两个条件：首先是目标组分与对照品的保留时间相吻合；第二是在一定误差允许范围内，目标组分与对照品的离子比率值无显著性差异。因此，在确定质谱参数时，定量离子和定性离子的选择尤其重要。如果对照品中的产物离子受到背景信号的干扰将会严重影响定性、定量结果的准确性。如氯氟氰菊酯的两个同分异构体中，当前体离子为m／z 197时，定性离子m／z 91受化学背景干扰大，噪声明显，而定性离子m／z 141的信号响应强，峰形正常，在扫描时间窗内无干扰信号（见图1），因此将m／z 141作为氯氟氰菊酯的特征定性离子。

2.1.2 碰撞电压的优化

在三重四极杆串联质谱测定过程中，一般选取m／z大、信号响应强的离子（如基峰）作为前体离子，产物离子则选择前体离子裂解的特征性碎片，即第三个四极杆（Q3）允许通过的稳态离子。本研究分别通过全扫描模式（Q3 scan）和碎片离子扫描模式确定目标组分的前体离子及特征产物离子，然后对前体离子生成产物离子过程中所必需的碰撞气（CID，氩气）的碰撞电压（即产物离子获得最高响应值时的碰撞能）进行优化，以确定最终的MRM质谱参数。图2表示在不同碰撞电压的诱导解离作用下，敌敌畏和杀螟硫磷3组离子对的响应趋势图，各曲线的最高点所对应的横坐标即代表产物离子响应最高时的作用电压。各农药组分质谱参数的优化结果见表1。

图1 氯氟氰菊酯异构体不同定性离子的MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of different qualitative ions of cyhalothrin isomers

图2 不同碰撞电压下敌敌畏和杀螟硫磷3组产物离子的响应值Fig.2 Response values of three product ions of dichlorvos and fenitrothion under different collision voltages

表1 99种农药及内标的保留时间及质谱分析参数Table 1 Retention times and GC－MS ／MS conditions of the 99 pesticides and internal standard

表1 （续）Table 1 （Continued）

2.2 前处理方法的优化

2.2.1 提取溶剂的选择

由于本研究选取的农药种类多，极性相差较大，因此在考察提取溶剂时选取了3种极性适中的溶剂，分别为乙腈、乙酸乙酯和丙酮。在空白白芍基质中添加0.10 mg／kg的99种农药及内标，按1.2节前处理步骤平行操作3份，对提取效率进行比对。实验结果表明，当采用丙酮提取时，回收率较乙酸乙酯和乙腈低，但3组结果不存在显著性差异，基本满足回收率要求。样品在提取前用水浸泡时间较长，此时农药组分已基本从植物组织中释放出来，因此乙腈和乙酸乙酯均能较好的提取目标组分，因乙腈毒性较大，综合考虑，最终选取乙酸乙酯为提取溶剂。

2.2.2 SPE柱净化效果的比较

白芍基质复杂，主要含有单萜及单萜苷类、鞣质和黄酮类等成分［13］，色素含量较少。在进行农药残留分析时，供试品溶液往往需要经过适当的方法净化，否则难以获得准确的分析结果。本研究选取3种常用的固相萃取小柱，分别为 NH2柱、CARB／PSA柱和C18柱，按1.2节下进行前处理操作，图3为加标水平为0.05 mg／kg时各物质的回收率试验结果（n=3）。99种物质经3种小柱净化后回收率略有差异，其中NH2柱平均回收率为70%～120%的农药比例最高，达 97.0%，CARB／PSA柱（85.9%）次之，C18柱（82.8%）最低。

图3 3种固相萃取小柱的净化效果比较Fig.3 Comparison of purification effects of three solid－phase extraction columns

NH2和CARB／PSA的净化机理类似，其与杂质之间均存在极性相互作用和弱阴离子交换作用，对鞣酸和萜类等物质具有强吸附能力。虽然CARB／PSA中的石墨化碳还兼具吸附色素的功能，但是其特征性的正六元环结构，对平面型化合物如六六六、五氯硝基苯和四氯硝基苯等具有极强的亲和力，导致这些物质的回收率普遍偏低。此外，抑菌灵和硫丹硫酸酯经过CARB／PSA柱净化后，几乎检测不到其色谱峰。C18属于非极性填料，甲胺磷极性较大，理论上不能被C18吸附，但在C18柱的流出液中并未检测到该化合物。因此，综合考虑方法性能，最终选择NH2作为前处理净化材料。

2.2.3 淋洗液及用量考察

图4 99种农药的基质效应Fig.4 Matrix effects of the 99 pesticides

参考农业标准NY／T 761-2008《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》［14］，采用二氯甲烷以及不同比例的二氯甲烷-甲醇（体积比分别为 100∶1、100∶2、100∶3 和100∶4）混合溶剂分别淋洗氨基柱。以回收率为评价指标，结果表明，混合溶剂较单一溶剂效果好，可能是由于甲醇的加入能有效增强淋洗液的极性，使得极性较大的农药（如有机磷类农药）回收率显著增加。由于不同配比的淋洗液效果相当，考虑到淋洗液极性增强，共流出杂质增多，因此最终选择以二氯甲烷-甲醇（100∶1，v／v）作为淋洗液。同时对淋洗液的用量进行了考察，当淋洗体积为15 mL时，各组分的回收率均满足要求。最终确定采用15 mL二氯甲烷-甲醇（100∶1，v／v）淋洗氨基柱。

2.3 基质效应

由基质引起的信号增强或减弱效应在农药残留气相色谱分析中是非常常见的［15］，基质效应的存在对定量的准确性和重复性具有一定的影响［16，17］，白芍成分复杂，基质效应不可忽视。本文用溶剂和空白基质溶液配制的标准曲线的斜率比值来表征基质效应的大小，图4为99种农药在白芍基质中表现出的基质效应，当MF的值为正或者负时，代表基质增强或者抑制作用，当MF的值为0时，表示不存在基质效应。由图4可知，各物质普遍表现为基质增强作用，抑菌灵的增强效应最大，为60%。环氧七氯A、高效氯氟氰菊酯和溴氰菊酯表现为基质抑制效应。值得注意的是，环氧七氯和氯氟氰菊酯均存在同分异构现象，各异构体在色谱柱中的保留行为不同，具体表现为保留时间的微小差异（＜0.21 min），但基质效应的趋势却完全相反，这一现象可能是由于基质效应与物质的化学结构及性质有关［18］。在99种农药中，59%的农药基质效应较小（MF介于±20%之间），97%的农药表现为中等基质效应（MF介于±50%之间）。因此，在GC-MS／MS多农药残留分析中采用基质匹配标准溶液内标法对基质效应进行补偿。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性关系和定量限

在质量浓度为0.001～0.25 mg／L范围内，基质匹配标准工作溶液经GC-MS／MS测定后，以相对峰面积（A对照品／A内标）对相对质量浓度 C对照品／C内标作图，绘制工作曲线，结果表明，响应值和浓度之间均显示良好的线性关系，相关系数（r2）均大于0.99。

LOQ是指在可接受的准确性和精密度下，能够定量测定样品中待测成分的最低量或浓度［19］。本实验通过向白芍空白基质中添加多个较低水平的农药混合标准溶液分别进行基质加标试验，每个添加水平各平行6次，所得溶液经GC-MS／MS分析，计算平均回收率和相对标准偏差（RSD），回收率介于70%～120%及RSD小于20%的最低添加水平即为该物质的定量限。由表2可见，本方法的定量限范围为0.001～0.050 mg／kg。除乐果、抑菌灵、顺-氯丹、氧丰索磷砜、β-硫丹和倍硫磷氧亚砜外，其余农药的定量限均不超过0.01 mg／kg，符合欧盟农药残留限量的要求。

2.4.2 回收率及重复性

本文采用标准加入法，向空白样品中加入混合标准溶液和内标溶液，制备加标水平分别为0.05、0.10和0.20 mg／kg的样品各6份，按上述优化后的方法提取、净化样品，并进行GC-MS／MS分析，基质匹配内标法定量，计算平均回收率及精密度（RSD）。所有农药的回收率均在66.7%～128.0%之间，RSD在2.1%～18.3%之间。

表2 99种农药的线性范围、检出限、回收率及精密度（n＝6）Table 2 Linear ranges，limits of quantification （LOQ），spiked recoveries and precisions（RSDs）of the 99 pesticides（n＝6）

表2 （续）Table 2 （Continued）

表2 （续）Table 2 （Continued）

2.5 样品测定

按照所建立的方法，对来自亳州中药材市场的13批白芍样品进行了分析，其中4批样品检测到毒死蜱和p，p′-DDE这两种农药残留，检出率为31%。毒死蜱的最高残留量为 0.023 3 mg／kg，p，p′-DDE的最高残留量为0.015 9 mg／kg，均远远低于欧盟最大残留限量0.2 mg／kg和1 mg／kg。

3 结论

本文采用氨基固相萃取净化技术结合气相色谱-串联质谱联用法建立了白芍药材中99种农药同时检测的分析方法。采用基质匹配标准曲线内标法定量对基质效应进行了一定的补偿。该方法准确可靠、灵敏度高，为白芍中多种农药残留的同时测定提供了一种有力的分析手段。

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