天山雪莲药材与雪莲注射液指纹图谱相关性研究

刘 婧，许丽佳，何正有，李 维，邹 昆，姚 洁

(1.成都大学 四川抗菌素工业研究所，四川 成都 610052;2.成都大学 外国语学院，四川 成都 610106)

0 引 言

天山雪莲是菊科植物天山雪莲的干燥地上部分，具有补肾活血、强筋骨等功效［1］.雪莲注射液是由天山雪莲经提取、精制而成的注射液，具有消炎镇痛、消肿、活血化瘀等功效，临床上用于治疗急、慢性风湿性关节炎，类风湿性关节炎及骨关节炎引起的关节疼痛等症［2］.相关研究表明，中药指纹图谱能整体、特征与稳定地控制中药及其制剂质量［3－5］.本研究根据《中药注射剂指纹图谱的技术要求(暂行)》，对天山雪莲及雪莲注射液的指纹图谱进行研究，并通过指纹图谱各共有峰对两者的相关性进行研究，拟为提高雪莲注射液的工艺与质量控制水平提供参考.

1 仪器与材料

1.1 仪 器

实验所用仪器包括:Agilent 1200 型高效液相色谱仪(配有紫外检测器、自动进样器、四元梯度泵、在线脱气装置、Agilent Chem Station 色谱工作站，美国Agilent 公司);Ultimate XB-C18色谱柱(250 ×4.6 mm，5 μm，美国Welch 公司);AE240 型分析天平(瑞士METTLER 公司).

1.2 试 药

实验所用试药包括:甲醇，色谱纯，由国药集团化学试剂有限公司生产;水为超纯水，其他试剂均为分析纯;紫丁香苷(批号，111574－200603)、绿原酸(批号，110753－ 200413)、芦丁(批号，100080－200707)对照品，均购于中国药品生物制品检定所.

1.3 样 品

实验所用样品包括:天山雪莲(新疆和静)，由国药集团新疆制药有限公司提供，经成都中医药大学胡慧玲老师鉴定为菊科植物天山雪莲的干燥地上部分，符合《中国药典》2010年版一部有关各项的规定，共10 批.雪莲注射液共11 批，由国药集团新疆制药有限公司提供.

2 方法与结果

2.1 指纹图谱色谱条件

实验的色谱条件为:色谱柱为Ultimate XB-C18(4.6 ×250 mm，5 μm).以0.06%醋酸水为流动相A，以0.14%醋酸甲醇为流动相B.梯度洗脱，0 ～18 min，B(5%)，流速(0.5 mL·min－1);18 ～45 min，B(5% ～22%)，流速(0.5mL·min－1);45 ～55 min，B(22%)，流速(1.0 mL·min－1);55 ～95 min，B(22% ～60%)，流速(1.0mL·min－1);95 ～100 min，B(60%)，流速(1.0 mL·min－1);柱温为25℃，检测波长为260 nm，进样量为5 μL;理论板数按绿原酸峰计算应不低于8 000.

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备.

精密称取紫丁香苷、绿原酸、芦丁对照品适量，120 ℃干燥至恒重，加甲醇制成每1 mL 中分别含紫丁香苷、绿原酸、芦丁0.118、0.108、0.2092 mg 的对照品溶液.

2.2.2 天山雪莲供试品的制备.

取雪莲粉末4 g，过三号筛，加100 mL 水，称重，超声提取30 min，室温放置，用水补重，用0.45 μm微孔滤膜过滤，制得供试品溶液.

2.2.3 雪莲注射液供试品的制备.

取本品用0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，制得注射液供试品溶液.

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验.

取天山雪莲供试品溶液和雪莲注射液供试品溶液各1 份，连续进样6 次，检测其指纹图谱，以紫丁香苷峰为参照峰，计算主要共有峰的相对保留时间及相对峰面积.结果显示，其相对保留时间的RSD均＜0.571%，相对峰面积的RSD 均＜1.644%，表明本方法精密度良好.

2.3.2 稳定性试验.

取天山雪莲供试品溶液和雪莲注射液供试品溶液各1 份，分别于0、4、8、12、24、36 h 检测指纹图谱，以紫丁香苷峰为参照峰，计算主要共有峰的相对保留时间及相对峰面积.结果显示，其相对保留时间的RSD 均小于1.493%，相对峰面积的RSD 均小于2.437%，表明本方法稳定性良好.

2.3.3 重复性试验.

取天山雪莲供试品溶液和雪莲注射液供试品溶液各6 份，分别检测其指纹图谱，以紫丁香苷峰为参照峰，计算主要共有峰的相对保留时间及相对峰面积.结果显示，其相对保留时间的RSD 均小于1.547%，相对峰面积的RSD 均小于2.669%，表明本方法重复性良好.

2.4 样品测定

按照高效液相色谱法［1］分别精密吸取混合对照品溶液、天山雪莲供试品溶液和雪莲注射液供试品溶液5 μL，注入液相色谱仪，记录100 min 色谱图.

2.5 指纹图谱共有模式的建立

分别将10 批天山雪莲和11 批雪莲注射液的指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件，采用中位数法生成天山雪莲和雪莲注射液的对照图谱.指纹图谱如图1、2 所示，对照图谱如图3、4 所示.

图1 天山雪莲指纹图谱

图2 雪莲注射液指纹图谱

图3 天山雪莲对照图谱

图4 雪莲注射液对照图谱

2.6 相似度分析

分别将10 批天山雪莲和11 批雪莲注射液的指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件，对各样品与其对照图谱进行比较，其相似度结果见表1.

表1 天山雪莲和雪莲注射液各批样品的相似度分析结果

2.7 天山雪莲与雪莲注射液相关性分析

在天山雪莲对照图谱中，第9 号峰为紫丁香苷峰，在雪莲注射液对照图谱中，第14 号峰紫丁香苷峰.因为紫丁香苷在天山雪莲和雪莲注射液中出峰时间及峰面积较稳定，所以选择紫丁香苷为参比峰.以紫丁香苷的出峰时间为1，分别计算各共有峰的相对保留时间，结果见表2.

表2 天山雪莲和雪莲注射液各共有峰的相对保留时间

对天山雪莲与雪莲注射液各共有峰的相对保留时间对比分析可见，雪莲注射液中的峰1、5、6、7、9、11、14、15、17 均来自天山雪莲药材.作为天山雪莲含量测定成分的紫丁香苷、绿原酸和芦丁分别是天山雪莲对照图谱中共有峰的第9、10 和12 号峰，雪莲注射液对照图谱中第14、15 和17 号峰，其中绿原酸和芦丁的相对峰面积分别在天山雪莲中的1.12和3.36，雪莲注射液中的0.58 和0.67.

3 讨 论

1)本研究色谱条件分别考察了色谱柱、流动相、柱温和检测波长，选择图谱基线较平稳、色谱峰数目较多且分离度较好的色谱条件:Ultimate XBC18(4.6 ×250 mm，5 μm)色谱柱，0.06%醋酸水—0.14%醋酸甲醇，梯度洗脱，柱温25 ℃，检测波长260 nm.

2)对10 批天山雪莲样品进行分析，其相似度在0.866 ～0.926 范围，有两批样品(S1，S10)相似度小于0.90.由于天山雪莲生长在海拔3 500 m 以上，生长环境极为复杂，自然生长周期达5 ～8年，并且人工栽培困难，所以天山雪莲的化学成分有一定的差异［6－7］.

3)对11 批雪莲注射液进行分析，指纹图谱整体相似，各批次的色谱峰数和峰面积差异较小，其相似度大于0.90，可认为其相似度良好.实验结果表明，雪莲注射液制备工艺的稳定性良好，各批次样品差异较小.

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京:中国医药科技出版社，2010.

［2］陈惠忠，刘宣麟，薛桂蓬.雪莲注射液质量标准的研究［J］.新疆中医药，2006，24(5):76－78.

［3］顾英，冯怡，李玉敏.指纹图谱在中药物质基础中的应用［J］.中成药，2007，29(7):1048－1051.

［4］周建良，齐炼文，李萍.色谱指纹图谱在中药质量控制中的应用［J］.色谱，2008，26(2):153－159.

［5］屠鹏飞.高效液相色谱法制定中药材和中药注射剂特征指纹图谱的探讨［J］.中成药，2000，22(7):516.

［6］陈玉珍，李凤兰.药用资源植物雪莲化学成分及药理作用［J］.中国野生植物资源，2005，24(3):1－4.

［7］袁晓凡，赵兵，王玉春.雪莲的研究进展［J］.中草药，2004，35(12):1424－1426.

［8］国家药典委员会.中药注射剂指纹图谱实验研究技术指南(试行)［EB/OL］.［2002－04－27］.http://www.chp.org.cn.