重组Apoptin的叶酸修饰及诱导肿瘤细胞凋亡活性研究

董萍 彭海英 高璐 赵洪礼

重组Apoptin的叶酸修饰及诱导肿瘤细胞凋亡活性研究

董萍 彭海英 高璐 赵洪礼

为了使重组GST-Apoptin融合蛋白能够与肿瘤细胞靶向性结合，并发挥其特异性诱导肿瘤细胞凋亡的作用，本文采用化学方法将叶酸连接到GST-Apoptin融合蛋白，实验结果表明叶酸与GST-Apoptin融合蛋白的偶联率为6%，最佳偶联条件是20 mg/mL活化叶酸在pH 10.0条件下室温反应60 min。叶酸化的GST-Apoptin融合蛋白（folate-GST-Apoptin）具有显著诱导肿瘤细胞凋亡作用，1.0 μg/mL的folate-GST-Apoptin可使50%的肿瘤细胞（KG-1）凋亡，而对正常人外周血淋巴细胞没有诱导凋亡作用。

凋亡；叶酸；Apoptin

来源于鸡贫血病毒的鸡贫血病毒蛋白-3(vp3)对人的各种肿瘤细胞和异常转化细胞具有特异性杀伤作用。由于vp3能够选择性地诱导肿瘤细胞和转化细胞的凋亡，而不诱导正常细胞的凋亡，被命名为肿瘤特异性凋亡因子(Apoptin)[1-3]。研究结果表明，Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡不依赖于抑癌基因-53(p53)作用途径，也不被抑制细胞凋亡基因(Bcl-2)过量表达所抑制，因此有希望成为有效治疗癌症的新型生物制剂[4-5]。由于人肿瘤细胞表面没有鸡贫血病毒蛋白受体，故Apoptin蛋白不可能与人的肿瘤细胞结合而诱导肿瘤细胞凋亡，实验结果亦证明了这一点。为解决这一问题，本研究建立了重组GST-Apoptin融合蛋白叶酸修饰方法，以激活GST-Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡的活性，使GST-Apoptin融合蛋白能够与肿瘤细胞发生靶向结合，并诱导肿瘤细胞凋亡，以达到能够满足临床治疗肿瘤的目的。

1 材料和方法

1.1 仪器设备 Unic 2101型紫外可见分光光度计(上海Unic公司)、Startorious 1721型电子天平(德国)、85-2型恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器厂)、SHZ-88-1型台式水浴恒温振荡器(江苏太仓鹿河生化仪器厂)。

1.2 细胞与试剂 人KG1细胞株购于中国科学院上海细胞所，常规传代培养KG1细胞；叶酸(Sigma产品)，GST-Apoptin本实验室表达纯化，其他所用化学试剂均为国产，分析纯。

1.3 GST-Apoptin融合蛋白的化学化修饰

1.3.1 GST-Apoptin融合蛋白预处理 取纯化的GST-Apoptin融合蛋白溶解(1.5 mg/mL)10 mL，调至pH 9.0，室温搅拌下缓慢滴加入25%的戊二醛溶液(终浓度为0.2%)，搅拌12 h，对上述平衡液透析24 h，即得戊二醛活化GST-Apoptin融合蛋白的悬液。

1.3.2 叶酸活性酯的制备 500 mg的叶酸溶于10 mL二甲亚砜(已预先加入0.25 mL的三乙胺)，搅拌下加入适量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应过夜。过滤，除去反应中生成的副产物二环己基脲，减压浓缩至干。用乙醚洗涤残余固体，得浅黄色固体粉末，即叶酸活性酯。

1.3.3 Folate-GST-Apoptin的制备 取上述活化的GST-Apoptin液适量2 mL，加入30 mg/mL的叶酸活性酯的二甲亚砜溶液0.5 mL，室温搅拌2 h。用Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱去除游离的叶酸，收集先流出的有乳光部分，即Folate-GST-Apoptin胶体混悬液。过滤除菌，4℃保存备用。

1.3.4 Folate-GST-Apoptin偶联的证明及偶联程度的测定 将GST-Apoptin、Folate-GST-Apoptin和叶酸与GST-Apoptin混合物的胰蛋白酶水解液分别作紫外吸收图谱分析，验证叶酸是否与GST-Apoptin偶联。同时将叶酸配制成2～40 μg/mL系列浓度标准溶液，在358 nm处测定吸收度。

1.4 GST-Apoptin融合蛋白的化学化修饰制备工艺的优化

1.4.1 叶酸活性酯用量对偶联程度的影响 5份GST-Apoptin融合蛋白活化混悬液用NaCO3/NaHCO3缓冲溶液调pH为10，加入不同量叶酸活性酯的二甲亚砜溶液，室温搅拌，即Folate-GST-Apoptin胶体混悬液。用Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱进行分离，收集先流出的有乳光部分，加入适量胰蛋白酶液，37℃水解，水解液在358 rim处作吸光度测定。

1.4.2 反应时间对叶酸偶联程度的影响 取GST-Apoptin融合蛋白活化混悬液，用NaCO3/NaHCO3。缓冲溶液调pH为10，加入适量的叶酸活性酯二甲亚砜溶液，室温搅拌。定时取一定体积的反应液用Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱进行分离，收集先流出的有乳光部分，加入适量胰蛋白酶液，37℃水解，水解液在358 nm处作吸光度测定。

1.4.3 pH值对叶酸偶联程度的影响 由于叶酸活性酯在中性及酸性溶液中溶解度不好，在pH＜9的溶液中易析出沉淀，因此选择了9.0、9.5、10.0、10.5、11.0五个pH值来考察偶联反应的进行程度。取5份GST-Apoptin融合蛋白活化混悬液，用NaCO3/NaHCO3缓冲溶液分别调pH为9.0、9.5、10.0、10.5、11.0，加入适量的叶酸活性酯二甲亚砜溶液，室温搅拌。用Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱进行分离，收集先流出的有乳光部分，加入适量的胰蛋白酶液，37℃水解，水解液在358 nm处作吸光度测定。

1.5 Folate-GST-Apoptin体外诱导肿瘤细胞凋亡作用 采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法测定Folate-GST-Apoptin诱导肿瘤细胞发生凋亡的活性；人KG1细胞株(购于中国科学院上海细胞所)；常规传代培养KG1细胞；取生长良好的细胞，配制成4×103个/mL的细胞悬液；将细胞悬液加入96孔细胞培养板，0.1 mL/孔，37℃，5%CO2培养过夜；加入上述激活的apoptin，0.1 mL/孔，以125 μg/mL为起点，2倍稀释，每个滴度作4孔；37 ℃，5%CO2培养72 h；吸弃培养上清液，用磷酸盐缓冲液洗细胞2次；加入用无酚红RPMI1640配制的MTT(1 mg/mL)，50 μL/孔，37 ℃，5%CO2培养3 h；吸弃培养上清液，用磷酸盐缓冲液洗细胞2次；加入二甲基亚砜(DMSO)，50 μL/孔，37℃，10 min；用EL340 560 nm波长，检测各孔A值。试验设PBS组、叶酸组、GST-Apoptin组和叶酸＋GST-Apoptin组对照。

2 结果

2.1 Folate-GST-Apoptin偶联的证明及偶联程度的测定 GST-Apoptin的胰蛋白酶水解液紫外吸收图谱为典型的蛋白质紫外吸收图谱(图1A)，只在210 nm和280 nm处有吸收峰；而Folate-GST-Apoptin胰蛋白酶水解液紫外吸收图谱除有典型的蛋白质紫外吸收图谱外(图1B)，在358 nm处有明显的紫外吸收；并且与叶酸与GST-Apoptin混合物的胰蛋白酶水解液紫外吸收图谱基本一致(图1C)；说明叶酸已经连接到GST-Apoptin。

图1 GST-Apoptin(A)、叶酸偶联GST-Apoptin(B)、叶酸G与GST-Apoptin混合物(C)的胰蛋白酶水解液紫外图谱

2.2 Folate-GST-Apoptin制备工艺的优化 ①pH值对叶酸偶联程度的影响(图2)，可以看出叶酸偶联GST-Apoptin的反应最好在pH＝10时进行。②反应时间对叶酸偶联程度的影响(图3)，可以看出反应60 min后，反应基本达到平衡，增加反应时间对叶酸偶联量的增加没有太大影响。③叶酸活性酯用量对叶酸偶联程度的影响(图4)，可以看出叶酸活性酯的用量为15 mg时，叶酸偶联量不再增加。

采用上述最佳条件，pH 10.0，反应时间为60 min，叶酸活性用量为15 mg，得到叶酸偶联量为60.0 μg/mg GST-Apoptin的folate-GST-Apoptin。

2.3 Folate-GST-Apoptin对KG1细胞的凋亡诱导作用结果 1.0 μg/mL活化的apoptin可使50%以上的肿瘤细胞发生凋亡(图5)。而未叶酸修饰的GST-Apoptin组细胞与正常对照组细胞没有差异。

图2 pH值对叶酸偶联量的影响

图3 反应时间对叶酸偶联量的影响

图4 叶酸浓度对叶酸偶联量的影响

图5 叶酸修饰GST-Apoptin对KG1细胞的凋亡诱导作用

3 讨论

业已证明，Apoptin对人体各种组织器官来源的肿瘤细胞具有不同程度的凋亡诱导作用，而对正常组织细胞没有毒副作用，是迄今发现的没有毒副作用的抗肿瘤蛋白。但是由于种属间的差异，Apoptin的裸蛋白不能自主进入人体来源的细胞，包括正常细胞和肿瘤细胞。为了解决这一问题人们通常采用病毒载体(如腺病毒)将Apoptin基因转染到肿瘤细胞来发挥其抗肿瘤作用[6]；也有学者采用微注射的方法将重组的Apoptin蛋白注射到肿瘤细胞内，研究其抗肿瘤作用[7-8]。但这两种技术方法只适合实验室研究，而不利于临床应用和产业化。

众所周知肿瘤细胞表面有丰富的叶酸受体，其受体数量是正常细胞的数十倍之多，已经成为肿瘤治疗的一个新的靶向性靶点[9]。本文采用化学方法将叶酸连接到重组的GST-Apoptin蛋白，以期解决GST-Apoptin进入肿瘤细胞的理论问题，获得令人满意结果，并获得国家发明专利授权。

由于叶酸与GST-Apoptin表面的氨基反应形成酰胺键，胰蛋白酶水解蛋白是不完全水解，仅把蛋白水解成小肽。胰蛋白酶水解之后，并不能完全得到游离的叶酸，有部分的叶酸可能还与小肽相连接。GST-Apoptin的胰蛋白酶水解液在358 nm处基本无吸收，以GST-Apoptin胰蛋白酶水解液作为对照，可消除白蛋白的影响，使其不会干扰叶酸偶联量的测定。因而，采用紫外分光光度法测定叶酸偶联白蛋白纳米粒的叶酸偶联量。以A对叶酸浓度C进行线性回归，得回归直线方程为A＝0.019 6±0.002 5，r＝0.999 9，叶酸浓度C在2～41 g/mL范围内线性良好，这不仅证明了叶酸已经连接到GST-Apoptin蛋白上，而且能进行定量分析。优化了叶酸与GST-Apoptin蛋白连接反应条件，并证实叶酸化的GST-Apoptin蛋白对肿瘤细胞具有很好的凋亡诱导功能，为其进一步的深入研究和产业化打下了理论基础。

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To integrate fusion protein of recombined GST-Apoptin with cancer cell targeting so as to exert its function of peculiar induced tumor cell apoptosis.The paper adopts chemical process to connect folic acid with fusion protein of GST-Apoptin，and experiments show that the coupling rate of folic acid and fusion protein of GST-Apoptin is 6%，and the best coupling condition is 20 mg/mL excited folic acid reacts for 60 minutes in indoor temperature with pH 10.0.Folate-GST-Apoptin bears remarkable function of induced tumor cell apoptosis，and 1.0 μg/mL folate-GST-Apoptin can achieve 50%of tumor cell(KG-1)apoptosis，while having no function of induced tumor cell apoptosis on peripheral blood lymphocyte of normal people.

Apoptosis；Folic acid；Apoptin

2014-06-17)

1005-619X(2015)01-0007-03

10.13517/j.cnki.ccm.2015.01.003

116013沈阳军区大连疗养院桃源疗区检验科