双水相萃取—高效液相色谱法检测高效氯氰菊酯及其降解产物

王博文　唐爱星　韦滢军等

摘要：通过Plackett-Burman试验，建立一种乙腈-无机盐-水双水相萃取-高效液相色谱法检测高效氯氰菊酯及其降解产物3-苯氧基苯甲醛与3-苯氧基苯甲酸，确立双水相萃取体系的最佳条件为：V乙腈 ∶V样品溶液=1 ∶1，振荡时间3 min，氯化钠 ∶样品溶液=1 g ∶1 mL。在最佳萃取条件下，对生物降解体系中浓度分别为10、100 mg/L的底物和降解产物平均回收率为94.6%～98.3%，变异系数为2.1%～3.4%。该方法可以同时检测生物降解过程中高效氯氰菊酯及其降解产物3-苯氧基苯甲醛与3-苯氧基苯甲酸，操作简单，结果准确。

关键词：双水相萃取；高效液相色谱法；高效氯氰菊酯；3-苯氧基苯甲酸；3-苯氧基苯甲醛

中图分类号： O657.7+2 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0268-03

拟除虫菊酯类农药是一种广谱、高效的杀虫剂，由于其广泛使用而导致环境中存在大量残留[1-2] 。研究表明，拟除虫菊酯残留会危害哺乳动物和人类的健康，具有潜在的致癌性、生殖毒性、神经毒性以及引发急性中毒[3-5]。同时，高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯等多种拟除虫菊酯的降解中间产物3-苯氧基苯甲酸也具有生殖毒性，在土壤中迁移性比母体化合物更强，对环境更具危害。

生物修复在降解和消除农药残留方面具有安全、高效等特点，是治理农药环境污染的有效途径。利用微生物及其产生的降解酶来消除农药污染已成为目前研究的热点，而对降解体系中农药及其降解产物的检测是此类研究的基础。目前，拟除虫菊酯类农药常用的检测方法为有机溶剂萃取-气相色谱或者高效液相色谱法。气相色谱法具有灵敏度高、分析速度快等优点，但是不能对不易气化或受热易分解的农药进行检测，对3-苯氧基苯甲酸等酸性降解产物的检测通常需要衍生化。高效液相色谱法可以检测分子量较大、极性强与离子型的农药，具有检测效率高、灵敏度高、速度快和操作自动化程度高等优点，是农药残留分析的重要方法。通常农药萃取采用乙酸乙酯、环己烷等为萃取剂的液液萃取法，虽然这些溶剂对残留农药及降解产物有较好的溶解性，萃取回收率高，但采用高效液相色谱法检测时往往会出现溶剂峰的干扰，需要氮吹或其他净化处理，操作复杂，增大了试验误差。

双水相萃取法（aqueous two-phase extraction）是根据亲水性高分子聚合物或有机溶剂与无机盐在水溶液中超过一定浓度后可以形成两相，利用目标物在两相溶液中分配系数不同而进行分离的方法[6]，具有条件温和、价廉、溶剂消耗较少等优点，在生物物质萃取及金属离子分离测定中得到广泛应用[7]，如贾风燕等使用双水相萃取-高效液相色谱法检测鱼肉样品中6种拟除虫菊酯类农药，回收率为81.1%～964%[8]。乙腈是高效液相色谱常用的流动相，采用乙腈-无机盐水双水相萃取，可以避免高效液相色谱检测中溶剂峰对拟除虫菊酯及其降解产物峰的干扰，简化净化步骤，有利于检测分析。目前，有关拟除虫菊酯类农药的双水相萃取的报道还比较少。本研究通过建立一种乙腈-无机盐-水双水相萃取体系用于高效氯氰菊酯生物降解体系中底物及代谢产物的检测，以期对其他拟除虫菊酯类农药的检测具有借鉴意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa） GF31，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 （CGMCC）保藏，登记入册编号 CGMCC No.7173；95.8%高效氯氰菊酯标准品，由广西田园生物有限公司提供；97.0% 3-苯氧基苯甲醛与99.0% 3-苯氧基苯甲酸分别购于J&K chemical LTD与Acros Organics；乙腈色谱纯，购于Fisher公司；其他常用药品，购于西陇化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

ULTIMATE 3000高效液相色谱仪，配有紫外检测器，美国热电集团生产；LDZ4-1.2离心机，北京众益中和生物技术有限公司生产；EP214C分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司生产；H-1微型漩涡混合器，上海精科实业有限公司生产。

1.3 溶液配制与胞外酶制备

20 g/L高效氯氰菊酯贮备液的制备：准确称取 0205 8 g 高效氯氰菊酯原药，精确至0.2 mg，用乙腈定容至10 mL；2 g/L 3-苯氧基苯甲酸贮备液的制备：准确称取0020 2 g 3-苯氧基苯甲酸原药，精确至0.2 mg，用乙腈定容至10 mL；2 g/L 3-苯氧基苯甲醛贮备液的制备：准确称取0.020 6 g 3-苯氧基苯甲醛原药，精确至 0.2 mg，用乙腈定容至10 mL；0.02 mol/L磷酸盐缓冲溶液的制备：称取Na2HPO4·12H2O 7.169 g、KH2PO4 2.72 g，用蒸馏水溶解并定容至1 L，pH值调节至7.0；无机盐培养基（MS）：MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO4 0.5 g、Na2HPO4·12H2O 1.0 g，蒸馏水溶解并定容至1 L，pH值调至7.0；牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨 10.0 g、牛肉膏 5.0 g、NaCl 5.0 g，使用蒸馏水溶解并定容至1 L，pH值调节至7.0。培养基在121 ℃条件下灭菌 20 min。胞外粗酶液的制备：将牛肉膏蛋白胨培养基装于 250 mL 锥形瓶中，每瓶装液量为30 mL，120 ℃灭菌30 min；接入菌种，在30 ℃、120 r/min 摇床中培养18 h；将发酵培养液用低温冷冻离心机在4 ℃、6 000 r/min离心15 min；取上层清液，经045 μm滤膜过滤，再用Milipore 10 kDa超滤膜超滤获得超滤截留液，即为胞外粗酶液。

1.4 双水相萃取方法

将高效氯氰菊酯贮备液用无机盐培养基（MS）稀释为 50 mg/L；取1 mL溶液，加入0.1 mL 1 mol/L盐酸酸化；加入一定量乙腈，涡旋振荡一定时间，再加入一定量的NaCl振荡，以3 000 r/min离心10 min，取上层液，通过0.22 μm有机相膜过滤后进行高效液相色谱分析。高效氯氰菊酯回收率（Recovery rate，R） 计算公式为：R=ACu/C0，其中，A为稀释倍数，Cu为上相溶液中高效氯氰菊酯的量，C0为初始加入的高效氯氰菊酯的量。3-苯氧基苯甲醛与3-苯氧基苯甲酸双水相萃取方法及回收率计算方法同上。endprint

1.5 降解体系中高效氯氰菊酯及其降解产物检测

将菌体GF31接种于含有50 mg/L高效氯氰菊酯的无机盐培养基中，一定条件下降解3 d，取样经双水相萃取后进行高效液相色谱法检测。将胞外酶加入到含有50 mg/L高效氯氰菊酯的磷酸盐缓冲溶液中，一定条件下降解48 h，取样经双水相萃取后进行高效液相色谱法检测。

1.6 高效液相色谱检测

检测条件：色谱柱AQUASIL C18（4.6×250 mm×5 μm）柱，紫外检测器波长为235 nm，流动相为乙腈 ∶水=85 ∶15（体积比，下同），流速为1 mL/min，温度30 ℃，进样量20 μL，采用自动进样器控制。采用外标法定量，高效氯氰菊酯标准曲线回归方程为y=0.678x+0.489，r2=0.999 7，其中，y为高效氯氰菊酯总峰面积，mAU/min，x为高效氯氰菊酯进样浓度，mg/L。3-苯氧基苯甲酸标准曲线回归方程为y=1.121x-0.169，r2=0.999 5，其中，y为3-苯氧基苯甲酸峰面积，mAU/min；x为3-苯氧基苯甲酸进样浓度，mg/L。3-苯氧基苯甲醛标准曲线回归方程为y=2.514x-0.137，r2=0999 3，其中，y为3-苯氧基苯甲醛峰面积，mAU/min；x为3-苯氧基苯甲醛进样浓度，mg/L。

2 结果与分析

2.1 双水相萃取优化试验方案设计

试验选取可能影响高效氯氰菊酯萃取的3个因素进行Plackett-Burman试验，3个因素分别为乙腈（A）、振荡时间（B）和氯化钠量（C），每个因素选取高水平1和低水平-1（表1），以高效氯氰菊酯回收率为响应值（表2），利用Minitable软件对试验结果进行分析，得出各因素的t值和可信度水平。由表3、图1、图2可见，乙腈加入量对萃取有显著影响，乙腈加入量越少，萃取回收率越高，当乙腈 ∶样品溶液=1 ∶1时，高效氯氰菊酯回收率最高，达到98.0%；当乙腈 ∶样品溶液=5 ∶1时，回收率仅为84.4%。其他2个因素对试验没有显著影响。因此，采用乙腈 ∶样品溶液=1 ∶1、振荡时间3 min、氯化钠 ∶样品溶液=1 g ∶1 mL为乙腈-氯化钠-水双水相萃取高效氯氰菊酯的最优条件。

2.2 回收率的测定

高效氯氰菊酯生物降解体系分别为菌体降解体系与酶降解体系，菌体降解在无机盐培养基中进行，酶降解在磷酸缓冲溶液中进行，分别考察无机盐培养基和磷酸缓冲溶液中高效氯氰菊酯及其降解产物3-苯氧基苯甲酸和3-苯氧基苯甲醛的双水相萃取法效果。由表4可见，对10、100 mg/L高效氯氰菊酯、3-苯氧基苯甲酸和3-苯氧基苯甲醛的平均回收率为94.6%～98.3%、变异系数为2.1%～3.4%。有文献报道，平均回收率为90%～96%、变异系数为1.1%～39%，即认为检测方法比较精确[9]。因此，本试验方法可精确定量测定高效氯氰菊酯、3-苯氧基苯甲酸和3-苯氧基苯甲醛。

2.3 降解体系中高效氯氰菊酯及其降解产物的检测

由图3可见，高效氯氰菊酯、3-苯氧基苯甲酸和3-苯氧基苯甲醛标准品在12 min内可以实现完全分离，符合分析要求。根据标准曲线，在实际酶降解体系中，可以同时定量检测底物高效氯氰菊酯与其降解产物3-苯氧基苯甲酸与3-苯氧基苯甲醛（图4）。同理， 菌降解体系中各物质也可以定量检测（图5），但是仅检测到3-苯氧基苯甲酸，未检测到3-苯氧基苯甲醛，这可能是因为降解产生的3-苯氧基苯甲醛被菌体迅速转化为3-苯氧基苯甲酸。Tallur等发现，微球菌（Micrococcus sp.）CPN 1可以把3-苯氧基苯甲醛转化为3-苯氧基苯甲酸[10]，这与本试验结论一致。

3 结论

微生物降解拟除虫菊酯类农药具有速度快、操作简单、减少二次污染、成本低廉等优点，具有良好的发展前景，目前已有较多关于微生物降解拟除虫菊酯的报道。3-苯氧基苯甲酸与3-苯氧基苯甲醛是高效氯氰菊酯、甲氰菊酯等多种拟除虫菊酯的主要代谢产物，是研究此类农药降解进程及降解机理的重要标的物。目前，研究者采用不同方法分别检测拟除虫菊酯和其降解产物3-苯氧基苯甲酸与3-苯氧基苯甲醛[11-12]，操作复杂，费时费力。

本研究建立了一种乙腈-无机盐-水双水相萃取系统，用于高效液相色谱法检测生物降解体系样品中高效氯氰菊酯及其降解产物，具有萃取与净化的优点，操作简便，结果准确，能同时检测氯氰菊酯生物降解体系中底物与降解产物，这为其他拟除虫菊酯类农药和环境污染物的检测提供了借鉴。

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